Botanik: Pinus nigra (Schwarzkiefernadel) in Autofluoreszenz *

Begonnen von Rolf-Dieter Müller, Oktober 08, 2019, 13:33:58 NACHMITTAGS

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Rolf-Dieter Müller

Ich bin gerade dabei mein kleines Schwarzes für Fluoreszenzmikroskopie vorzubereiten.

Zum Test suchte ich ein geeignetes Objekt und bin mit der Schwarzkiefernadel fündig geworden und habe erst einmal nachstehende Referenzaufnahmen mit Unendlichoptik gemacht.

Querschnitte einer Kiefernadel bekommt man recht gut mit dem Haga-Rasierklingenmikrotom hin, die Schnittdicke ist so ca. > 40 µm.

Alle Autofluoreszenzaufnahmen sind Fluoreszenz mit Blauanregung (Zeiss Filtersatz 09).

Zuerst einmal die Übersicht, es sind 4 Einzelaufnahmen mit dem 10x Plan-Apochromat mit Photomerge zusammengesetzt.




Diese ausgeprägte Gelbgrünfluoreszenz unten links (ca. 7 Uhr) habe ich bei Pinusnadeln so noch nicht gesehen und kann sie mir nicht erklären. Zumindest wird es eine Schädigung mit was auch immer sein.

Die Stelle etwas größer dargestellt in einer Einzelaufnahme mit dem 20x Plan-Apochromat.




Eine weitere Vergrößerung der betreffenden Stelle in Hellfeld mit dem 40x Plan-Neofluar.




Ich fand den Zufallsfund einigermaßen interessant, um das Mikrofoto-Forum mit diesen Autofluoreszenzaufnahmen zu ergänzen.

Viele Mikrogrüße,
Rolf-Dieter Müller

M.Butkay

Hallo Rolf-Dieter,

auch wenn ich kein Schnippler bin, hat mich doch die plastische Tiefenwirkung der Schwarzkiefernnadel in der Fluoreszenzanregung sehr beeindruckt. Könnte auch als eine Kiefernmaske durchgehen... ;) Das Hellfeldfoto gefällt mir auch sehr gut mit seinen Farben.

Danke Dir fürs zeigen und ergänzen der Autofluoreszenz in diesem Forum,

Michael
Captain Kirk (Wächter des Plankton...)

Klaus Herrmann

Sehr schön die Rot-Fluoreszenz der Chloroplasten in der Detailaufnahme lieber Rolf-Dieter.

Da passt das schöne Präparat das du mir vor 8 Jahren mal geschenkt hast gut dazu! Färbung Wacker W-3A und Blauanregung
Mit herzlichen Mikrogrüßen

Klaus


ich ziehe das freundschaftliche "Du" vor! ∞ λ ¼


Vorstellung: hier klicken

reblaus

Hallo Rolf-Dieter -

wieder TOP-Bilder! Die gelbe Fluoreszenz rührt in der Tat von einer Abwehrreaktion gegen Angriffe durch Organismen oder auch mechanische Schödigungen. Es handelt sich u.a. um Ligninbausteine, Flavonoide u.ä Substanzen, also nicht spezifisch synthetisierte "Phytoalexine".

Viele Grüße

Bob

Hallo zusammen,
tolle Fotos!
Vielen Dank für die Erklärung der Abwehrreaktion, Rolf!
Da könnte man ja auch erstmal das Mikroskop auseinanderbauen, wenn man das nicht wüsste! 8)

Viele Grüße,

Bob

Heiko

#5
Hallo Rolf-Dieter,

finde Deine Aufnahme beeindruckend, so wie einen die Strukturen ,,anspringen".
Hast Du eine Vermutung bezüglich des ,,Gelbausbruchs" auf 7.30 Uhr? Ein Gewebs-Artefakt unbekannter Ursache?

Viele Grüße,
Heiko

Nachtrag
Habe oben wieder einmal nicht sorgfältig gelesen, Ihr habt die Sache dort ja schon diskutiert.

Rolf-Dieter Müller

#6
Liebe Mikrofreunde,

erst einmal vielen Dank für Eure Anmerkungen zu diesen Aufnahmen. Ich habe mich über jede einzelne Antwort gefreut. Was mich überrascht, auch die Hellfeldaufnahme scheint erwähnenswert zu sein. Warum, darüber muss ich noch einmal nachdenken. Vielleicht habe ich aber nur einfach mit Glück die optimale Schichtdicke erwischt. Im Gegensatz zu meiner Gewohnheit Hellfeldaufnahmen anfangs zu machen, ist diese Aufnahme zum Schluss entstanden, das Wasser begann schon vom Deckglasrand her zu verdunsten.

@Klaus, der Pinus nigra-Schnitt gefärbt und in Sekundärfluoreszenz passt ja sehr gut für ein Vergleich zur Autofluoreszenz.

@Rolf, Deine Erklärung der gelben Fluoreszenz als Abwehrreaktion ist ja jetzt spannend und macht Lust auf mehr. Es lohnt sich ja offensichtlich schon, nicht Erwartetes gleich als Artefakt oder Verunreinigung abzutun und zu verwerfen.

@Heiko, eine größere Beschädigung war nicht an der Kiefernadel, die hätte ich dann auch nicht geschnitten. Meine Vermutung wäre, dass die Penetrierung über eine Spaltöffnung gekommen ist. Aber das ist jetzt reine Spekulation, wie auch Vermutungen über die Ursache eine wäre. Bei künftigen Schnitten werde ich einmal gezielt darauf achten und besonderes Augenmerk auf die Spaltöffnungen richten.


Jetzt will ich aber mein Ziel, das kleine Schwarze mit einer Fluoreszenzeinrichtung auszustatten, weiter verfolgen. Das ,,kleine Schwarze" ist übrigens ein Zeiss Standard Junior.

Anfang letzten Jahres hatte ich von Stephan Hiller für mein Zeiss Standard und den FL IV Auflicht-Fluoreszenz-Kondensor eine Leuchte mit einer 467 nm LED und ein Steuergerät bezogen.

Das habe ich jetzt einmal an meinem ,,Junior" für Auflichtfluoreszenz mit Blauanregung getestet. Es ist wiederum der Filtersatz 09, passend für das FL IV. Ich habe aber vor einiger Zeit den 520 nm-Sperrfilter gegen ein 515 nm-Sperrfilter getauscht.

Die nachstehende Aufnahme wurde dann als Einzelaufnahme mit dem 6,3er Neofluar gemacht, als Kamera habe ich die Nikon 1 J5 genommen. Übrigens, der Schnitt ist aus der o.g. Schnittserie und lag 24 Stunden in abgekochtem entmineralisiertem Wasser. Geht wohl noch für Fluoreszenz.




Ergebnis: Das ,,Junior" kann Fluoreszenz und ich bin jetzt diesbezüglich sehr mobil geworden.

Dann bin ich aber noch überrascht, wie intensiv diese Auflichtfluoreszenz ist. Besser als an meinem Axio. Da habe ich dann eine Baustelle.


Um beim ,,kleinen Schwarzen" zu bleiben, das alles soll aber nur ein Zwischenschritt sein.


Viele Mikrogrüße,
Rolf-Dieter

Rolf-Dieter Müller

Bevor es mit dem ,,Junior" weitergeht, kurz zurück zur Unendlichoptik.

Wolfgang liftboy hat in diesem Beitrag für Anregungslicht mit einer UV-Taschenlampe blank gezogen, um Sekundärfluoreszenz zu erreichen: https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=35246.msg257728#msg257728 .

Bei der Pinus nigra-Nadel geht das auch mit Autofluoreszenz. Meine Ultraviolett-Taschenlampe leuchtet so um die 400 nm und mit dem Zeiss Filtersatz 05 bekommt man diese Autofluoreszenz in Ultraviolettanregung. Zwei Einzelaufnahmen mit dem 10x Plan-Apochromat sind zu diesem Übersichtsbild zusammengesetzt.




Die Aufnahmen habe ich im abgedunkelten Raum gemacht. Belichtungszeit 25 Sekunden.


Viele Mikrogrüße,
Rolf-Dieter

Heiko

Hallo Rolf-Dieter,

das ist noch aparter gelungen.

Gruß, Heiko

Bob

Lieber Rolf-Dieter,
der Aufwand hat sich gelohnt - tolles Foto!
Bei solchen Belichtungszeiten wird man nochmal an die Grundlagen sorgfältigen Arbeitens erinnert: Bei meinem Fluoreszenz-Test hatte ich ein komisches Artefakt im Foto. Ursache: Lichteintritt über das andere Okular des Binos. ???

Viele Grüße, und halte uns auf dem Laufenden,

Bob

Rawfoto

Guten Morgen Rolf-Dieter

Motivierender Beitrag - bin auch gerade dabei mein BX60 in diese Richtung zu beleben😊
Was ich nicht erwartet hätte, das nach dem Schnitt die Ablegung im Wasser bei der Dauer sich nicht negativ auswirkt. Oder ist die lange Belichtungszeit zum Teil dadurch ausgelöst.


Sehr Gut sieht man den Unterschied von unterschiedlicher Filterung/Beleuchtung.
Für mich spannend, wie verhalten sich andere Nadeln - wenn ich Einsatzbereit bin muss ich da einen Versuch starten.

Liebe Grüße

Gerhard
Gerhard
http://www.naturfoto-zimmert.at

Rückmeldung sind willkommen, ich bin jederzeit an Weiterentwicklung interessiert, Vorschläge zur Verbesserungen und Varianten meiner eingestellten Bilder sind daher keinerlei Problem für mich ...

mikropit

Hallo Rolf Dieter,
jetzt bin ich beruhigt mit Deinen 25 sec Belichtungszeit mit Deinen super Bildern. Ich experimentiere auch gerade mit Fluoreszenz mit Blauanregung und konnte kein vernünftiges Bild hinbekommen. Bei meiner Toupcam kann ich nur max 2 Sek. belichten.
Weiss jemand wie man diese Belichtungszeit noch höher setzen kann? Mit dem Schieberegler in der Software bin ich ganz rechts am Anschlag.
vG
Peter
mikropit

Nikonudo

Hallo Rolf-Dieter,


als Neuling kann ich nur staunen. Ich finde die Aufnahmen
so gut, das ich mich damit in den nächsten Tagen mal beschäftige.
Vielleicht schafft das ja auch ein Anfänger.


LG Udo
Meine Fotos werden nie perfekt sein. Aber wenn ich ein Foto zeige, dann gefällt es MIR.
Ich arbeite mit Olympus BH 2 Mikroskope in Auflicht, Durchlicht, Polarisation und Fluoreszenz.
Fotografiert wird mit Nikon D850 und Z6II in Kombi mit Stackshot, Helicon Focus 7, Zerene Stacker, Smartshooter 4

d65

Lieber Rolf Dieter,

ganz herzlichen Dank für diese hervorragende Anregung für fluoreszierende Testpräparate :). Wir brauchen manchmal "irgendwas", das fluoresziert. Eine Kiefer steht vorm Gebäude, da gibt es auch im Winter Material. Und Glückwunsch zu Deinen sehr schönen Bildern.

Ich hab mich auf die Schnelle auch mal versucht, dürfte aber Pinus sylvestris sein. Nicht das ich mich bei Kiefernarten auskenne, ich vermute es aus statistischen Gründen, die wird halt häufiger angepflanzt, denke ich. Mein Bild zeigt - im Vergleich mit Deinen - vor allem, dass auch das Schneiden eine Kunst ist, die gelernt sein will. Ob die restlichen Unterschiede an der anderen Art oder der anderen Aufnahme liegen (Einzelne Ebene, 5x, 405 nm Anregung, Quadruppel-Beamsplitter) vermag ich nicht zu sagen. Schon auffällig ist, das hier die blaue Fluoreszenz sich auf die Mitte beschränkt und nicht auch außen am Rand zu finden ist. Vielleicht doch eher ein Artunterschied.

Beim herumspielen mit dem Präparat sind mir dann auch gleich ein paar Probleme aufgefallen, die ich angehen sollte. Von daher hat es sich schon gelohnt.
Also noch mal herzlichen Dank

Steffen


Rolf-Dieter Müller

Liebe Mikrofreunde,


auch hier vielen Dank für Eure Anmerkungen.


Zitat von: Heiko in Oktober 10, 2019, 21:14:17 NACHMITTAGS... das ist noch aparter gelungen. ...
@Heiko, so könnte man es sehen, vielleicht weil die Dominanz des fluoreszierenden Chlorophylls nicht so ausgeprägt ist und so die Farben etwas ausgeglichener wirken.


Zitat von: Bob in Oktober 10, 2019, 21:20:00 NACHMITTAGS... Bei meinem Fluoreszenz-Test hatte ich ein komisches Artefakt im Foto. Ursache: Lichteintritt über das andere Okular des Binos. ??? ...
@Bob, das schließe ich bei mir konsequent aus, denn gerade bei Floureszenzaufnahmen schalte ich den Fotoport auf 100% oder nehme einen Geradtubus, an dem die Kamera adaptiert ist. Und dann noch unbedingt die Anmerkung von Horst Wörmann beachten, was er auch mit einem Fotobeispiel belegt hat: https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=35266.msg257844#new


Zitat von: Rawfoto in Oktober 11, 2019, 08:52:47 VORMITTAG... das nach dem Schnitt die Ablegung im Wasser bei der Dauer sich nicht negativ auswirkt. ... Für mich spannend, wie verhalten sich andere Nadeln ...
@Gerd, die Schnitte lagen bis zu 24 Stunden im Wasser und ich bekam immer noch die erwartete Fluoreszenz, gerade bei Blauanregung. Bei der Kiefernadel scheint es einigermaßen zu funktionieren. Ich würde es aber nicht grundsätzlich darauf ankommen lassen und immer direkt nach dem Schneiden mikroskopieren und fotografieren. Die lange Belichtungszeit ist eher in geringerer Intensität des Anregungslichts und im größeren Sensorformat der verwendeten Kamera (Vollformat!) begründet. Und, das mit den anderen Nadeln ist eine richtig gute Idee.


Zitat von: mikropit in Oktober 11, 2019, 09:06:37 VORMITTAG... Ich experimentiere auch gerade mit Fluoreszenz mit Blauanregung und konnte kein vernünftiges Bild hinbekommen. Bei meiner Toupcam kann ich nur max 2 Sek. belichten. ...
@Peter, vielleicht liegt es am Anregungslicht? Die LED sollte bei Blauanregung sehr nah an 470 nm kommen und mit maximaler Leistung betrieben werden. Wenn Deine Kamera trotzdem damit nicht zurechtkommt, würde ich über eine Canon DSLR nachdenken.


Zitat von: Nikonudo in Oktober 11, 2019, 09:08:13 VORMITTAG... so gut, das ich mich damit in den nächsten Tagen mal beschäftige. Vielleicht schafft das ja auch ein Anfänger ...
@Udo, warum nicht? Einfach machen.


Zitat von: d65 in Oktober 11, 2019, 17:40:43 NACHMITTAGS... Schon auffällig ist, das hier die blaue Fluoreszenz sich auf die Mitte beschränkt und nicht auch außen am Rand zu finden ist. Vielleicht doch eher ein Artunterschied. ...
@Steffen, am Rand sehe ich aber schon in Deinem Bild blaue Fluoreszenz, wenn auch nur äußerst schwach. Mit meinem 5x Mikroskopobjektiv würde ich auch nicht mehr hinbekommen und habe deshalb den Schnitt mit dem 10x/0,3 Plan-Apochromat aufgenommen.


Viele Grüße,
Rolf-Dieter