Mikroskop + High Speed Kamera

[mimi]

Hallo zusammen,

Ich möchte dieses Paper nachstellen: https://www.mdpi.com/2072-666X/10/10/645/htm
Hier eine kurze Zusammenfassung:
Erythrozyten werden mithilfe von einem sich immer weiter verengenden Kanal auf ihre Verformbarkeit untersucht. Der Kanal hat Dimensionen im Mikrometer-Bereich. Im Bild ist das Setup dargestellt: Ein invertiertes Mikroskop, an das eine High Speed Kamera angeschlossen ist. Auf dem Objekttisch liegt der Mikrochip: Der ist aufgebaut aus einem Quader aus PDMS (sowas wie Silikon), in dem sich unten der Kanal befindet. Der PDMS Quader ist fest mit einem Objektträger verbunden, der auf dem Objekttisch aufliegt. Über dünne Schläuche ist der Kanal auf der einen Seite mit einer Spritzenpumpe verbunden, auf der anderen Seite werden die austretenden Erythrozyten gesammelt. Die strömenden Erythrozyten werden per Video aufgenommen und ihre Form über Nachbearbeitung analysiert.
Verwendet wird ein IX71 Olympus und eine Photron SA3 sowie folgende Parameter: Vergrößerung 40x, NA=0,75, 3000 fps, Belichtungszeit 13,3 µs

Ich habe ein Leica DM IL LED mit 40x Vergrößerung und Phasenkontrastobjektiv (https://www.leica-microsystems.com/de/produkte/objektive/objectivefinder/objective/506298/ - nicht wundern, die haben dort ein falsches Bild eingefügt), NA=0,55.

Leider sind meine Bilder nicht mal ansatzweise so gut wie die im Paper - sie sind viel zu dunkel. Zum Testen habe ich zuerst Erythrozyten auf einem Objektträger mit Deckglas fotografiert. Ich muss die Aperturblende ein gutes Stück schließen, um genügend Kontrast zu haben, aber bei einer so niedrigen Belichtungszeit ist das Bild viel zu dunkel. Wenn ich die Belichtungszeit höher einstelle, reicht die Helligkeit zwar aus, aber im Kanal verschwimmen die Konturen der Erythrozyten und eine Auswertung ist unmöglich.

Liegt es an der numerischen Apertur? Also ist NA=0,55 einfach zu niedrig, um das ordentlich abzubilden?
In einem ähnlichen Paper habe ich auch gelesen, dass die den Versuch mit Phasenkontrast machen. Das Bild ist ebenfalls schön hell und sehr kontrastreich. Wenn ich das probiere, sieht der Kanal verschwommen und leicht eingefärbt aus, und Zellen erkennt man nur sehr schlecht.

Hat jemand Tipps oder Ideen für mich? Habe ich irgendwas übersehen?
Danke schon mal und viele Grüße,
Miriam

[reblaus]

Hallo -

in den Angaben von Leitz zum Objektiv ist zwar der freie Arbeitsabstand erwähnt und auch, dass ein Korrekturring vorhanden ist, aber der Verstellbereich für die mögliche Deckglasdicke ist nirgends erwähnt. Schau doch mal die Skala des Korrekturrings an, welche Werte dort angegeben werden. Vielleicht liegt zu viel Glas/Silikat o.ä. zwischen der Frontlinse des Objektivs und dem Objekt?

Viele Grüße

Rolf

[Rene]

Hello Miriam, your images don't look sharp, which might explain why you need to close the condensor iris so far.

Concerning the camera, the images are fairly simple, you should be able to increase the sensitivity ('iso number') quite a bit. And start with checking for any neutral density and bluefilters in the light path of the microscope.

BTW, we have several flowcytometers in use (Cytobuoy), which makes use of similar kind of flow chambers. The highest magnification that we get it to work with is a 10x objective. And even at that mag it's hard to maintain the flow exactly in the right focal spot, as the objective has a depth of field of only ca 10um. With a 40x objective that decrease down to 1 um, which makes it enormously more difficult to get your blood cells flowing exactly in the right place through the imaging cell. Technologically challenging so to speak, good luck with that!

The use of an immersion objective (preferably water, however, check coverslip correction) might make things slightly better.

HTH, René

[Lupus]

Hallo Miriam,

nachdem der Strömungskanal zusätzliche optische Probleme bereiten könnte, müsste es erst einmal gelingen bei optimalen Bedingungen unter Deckglas und Objektträger ein vernünftiges Bild zu erzeugen. Wenn ich es richtig verstanden habe, sind die ersten drei Bilder so entstanden.

Das Mikroskop hat eine 5 W LED Beleuchtung, in der Mikroskopbeschreibung von Leica steht dass eine automatische Helligkeitsanpassung je nach Kontrastierverfahren erfolgt. Das klingt schon einmal seltsam, aber nicht nach gewünschter maximaler Helligkeit für den Fall wenn man sie wie bei dieser Anwendung braucht. Phasenkontrast erfordert mehr Lichtleistung wegen der Phasenblenden im Kondensor.
Eine zusätzliche Frage wäre, ob die LED-Beleuchtung gepulst betrieben wird und dann auch für kurze Belichtungszeiten im Bereich 15-20 µs geeignet ist.
Und es gibt nach Beschreibung zwei Kondensoren, mit NA 0.45 und NA 0.30. Der zweite könnte bei gleicher abgeblendeter NA heller sein falls er optimal konstruiert ist, der ist auch für kontrastärmere Objekte gedacht.

Liegt es an der numerischen Apertur? Also ist NA=0,55 einfach zu niedrig, um das ordentlich abzubilden?

Eine höhere NA des Objektives würde nur dann ein helleres Bild erzeugen wenn die Objektivvergrößerung etwa gleich bleiben würde (genauer: Die Bildgröße auf dem Kamerasensor nicht  wesentlich verändert wäre). Aber gleichzeitig steigen wegen der geringeren Tiefenschärfe dann die Abbildungsprobleme.

Ein anderes Problem (bezogen auf die Bildschärfe) könnte natürlich auch die Strömungszelle sein. Das PDMS hat einen deutlich vom Deckglas abweichenden Brechungsindex. Das Leica-Objektiv wird mit einem Einstellbereich von 0-2 mm für die Deckglasdicke angegeben, wenn aber das Material dick ist und auch qualitativ stark von Glas abweicht ist die Bildqualität kaum optimal weil man mit dem Einstellring nicht alle optischen Abweichungen ausgleichen kann.

Hubert