LEDs oder Laserdioden für Fluoreszenz?

[Hannival]

Hallo,

ich bin neu hier (Vorstellung siehe Mikroskopiker im Netz), also sorry für eventuell Ungeschicklichkeiten, Fehler, blöde Fragen, ..

Ich bin gerade dabei ein Eigenbau-Mikroskop von Weißlicht-Auflicht zu einem Fluoreszenzmikroskop umzubauen. Es soll auch langfristig nur für ausgewählte Fluoreszenzfarbbänder eingesetzt werden. Unter anderem suche ich gerade nach geeigneten Lichtquellen und denke insbesondere an Farb-LEDs.

Eine Frage um den Suchraum einzugrenzen vorab: sollte ich mich auch bei Laserdioden umsehen? Weiß da jemand etwas dazu?

Mein Wissensstand: ja, Laserdioden werden auch manchmal verwendet, aber LEDs scheinen deutlich häufiger im Einsatz.

Jetzt ist meine Einschränkung, "muss nur für einzelne Wellenlängenbereiche funktionieren" ja vermutlich etwas ungewöhnlich und viele LED-Beleuchtungen sind Weißlicht-LEDs, also frage ich mich, ob ich für den Sonderfall Farb-LEDs oder Laser-LEDs suchen sollte.

Konkret, als erstes wollte ich mich mit Cy3-Fluoreszenz beschäftigen (Anregung bei 550nm).

Falls jemand etwas dazu sagen kann, vielen Dank!

Grüße, Peter

[Rene]

Hallo Peter, verwende Schmalband-LEDs, aber verwende einen geeigneten Erregungsfilter. Schau mal hier: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/j.1365-2818.2006.01581.x für die Implementierung einer Fresnellens vor dem Anregungsfilter, ich habe sie bei https://www.fresneltech.com/ bestellt

Viel Erfolg,
René

[Lupus]

Hallo Peter,

die Wahl hängt auch von der benötigten Lichtleistung und des verwertbaren Abstrahlwinkels der Lichtquelle ab, also auch vom optischen Aufbau Deiner Beleuchtungseinrichtung.
Für eine Cy3-Anregung sind LEDs  mit etwa 550 nm (560 nm sind technisch mit dem Diodenmaterial GaP möglich) wegen der Überlappung mit dem Fluoreszenzspektrum bereits deutlich zu langwellig wenn man dann nicht mit sehr steilen Filtern arbeitet. Es gibt grüne LEDs mit etwa 520-525 nm Peakwellenlänge. Kurzwelligere LEDs mit 500 nm (Cyan) sind hinsichtlich der Anforderung an die Filterdurchlasskurve noch günstiger, dafür ist die Überlappung mit dem Absorptionsspektrum deutlich geringer.

Hubert

[Hannival]

Hallo Rene, Hallo Hubert,

danke für eure Tipps.

@Rene:
Die Literatur ist hinter einer Paywall, da komme ich kurzfristig nicht ohne zu zahlen ran (längerfristig habe ich vielleicht die Möglichkeit). Fresnel, ok das ist ein Gedanke der mir noch nicht kam, aktuell habe ich als Kollektor eine ganz normale Linse vor der LED.

@Hubert:
Abstrahlwinkel - ich kann relativ flexibel vor der LED Linsen einbauen, bin mal optimistisch das hinbiegen zu können (ev. zu unrecht :-)

Lichtleistung    - das ist die große Frage, ich habe null Ahnung wie viel Licht ich brauche. Mit meiner schwachen Weißlicht-LED funktioniert Fluoreszenz schon mal nicht. Ich versuche aktuell die möglichst hellste LED zu finden.

Wellenlängen :
Ich habe schon das Filterset für Cy3. Es besteht aus Anregungsfilter - dichroitischer Spiegel - Emissionsfilter (das ist vermutlich Standard?, theoretisch wäre ich auch mit weniger Teilen ausgekommen).

Anregungsfilter: 534nm/48nm (Center/FWHM)
Spiegel: 562nm+/-5nm (Grenzwellenlänge)
Emissionsfilter: 591nm/49nm (Center/FWHM)

Nach meinen Informationen ist Cy3 550nm/570nm (Anregung/Emission), allerdings hat mich die kurze Suche nach Spektren etwas verwirrt (habe unterschiedliche gefunden). Falls da jemand etwas Zuverlässiges hat, könnte mich das beruhigen, bei Filtern fühle ich mich zuhause, bei Fluoreszenzfarbstoffen nicht :-).

Sollte spektral soweit passen.

Zu dem von dir gesagten: ich hätte deshalb eher in der Region 520-525nm gesucht. Suche ist im Moment noch etwas unübersichtlich ...

[Werner]

Eine genaue Suche von Leds in der Region 520-525nm kann man bleiben lassen...
Die Emissionswellenlänge hängt primär vom Bandabstand des Halbleiters ab, kann also nicht variiert werden. Außerdem ist die Emission ziemlich breitbandig, siehe Datenblätter.

Das spielt aber für die Fluoreszenz auch keine große Rolle.
Ausgewiesene Fluoreszenzspektrometer bestehen aus einer Xenonlampe (breitbandig) und zwei unabhängigen Monochromatoren für die Anregungswellenlänge und für die Emissionswellenlänge. Um eine zunächst unbekannte Probe zu untersuchen, setzt man die Emission auf Verdacht fest in den Farbbereich, in dem die Probe leuchtet. Dann fährt man die Anregung von lang- nach kurzwellig durch und registriert die Intensität der Emission. Weil das in wässriger Lösung stattfindet, erhält man kein scharfes Linienspektrum, sondern eher eine Hügellandschaft.
Nun setzt man die Anregungswellenlänge auf den Wert der höchsten Emission und fährt den Emissionsmonochromator durch. Jetzt bekommt man ein etwas ausgeprägteres Spektrum, nach dem man sich die Wellenlängenbereiche aussuchen kann. Ein Ausprobieren der kleineren Peaks bringt meist keine weiteren Erkenntnisse. Ein schwacher Ramanpeak kann auch oft gefunden werden.
Wegen der Breitbandigkeit genügen für die Geräte kleine Monochromatoren mit einer Auflösung von 5 - 20 nm.

Xenonlampen bekommt man übrigens billig bei ebay als Auto-Nachrüstsatz, billig, weil in D der nachträgliche Einbau verboten ist. Wenn man das UV-Schutzglas zerbricht, hat man 2 schöne kleine Xenonlampen inclusive Steuergerät...

Gruß - Werner

[Lupus]

Hallo,

Eine genaue Suche von Leds in der Region 520-525nm kann man bleiben lassen...
Die Emissionswellenlänge hängt primär vom Bandabstand des Halbleiters ab, kann also nicht variiert werden.

Wieso denn das? Ich habe den Spektralbereich ja gerade deshalb genannt weil es da LEDs gibt. Z.B. erzeugt man mit InGaN Wellenlängen im Bereich etwa 505 nm und 525 nm (Peak), mit GaP z.B. Wellenlängen im Bereich 560 nm und 570 nm.
Natürlich hat man mit einer Xenonlampe mehr Leistung, aber die hilft auch nur wenn sie in der Bandbreite der Anregung liegt. Aus einer simplen grünen LED bei 520 nm für 1,50 € kann man immerhin 1.5 W Lichtleistung in der Bandbreite 505 - 535 nm (FWHM) heraus bekommen.

Nach meinen Informationen ist Cy3 550nm/570nm (Anregung/Emission), allerdings hat mich die kurze Suche nach Spektren etwas verwirrt (habe unterschiedliche gefunden).

Mag sein dass es da etwas unterschiedliche Darstellungen gibt. Hier wäre ein Beispiel https://www.researchgate.net/figure/Normalized-absorption-and-fluorescence-spectra-of-GFP-and-Cy3-The-excitation-wavelengths_fig2_342818729
Es geht ja nicht nur um die Lage der Maxima, sondern dass man insgesamt ausreichend Energie in die Anregung steckt, z.B. in die kurzwelligere Flanke des Absorptionsspektrums.

Hubert

[Hannival]

Hallo Werner,

danke für deinen Beitrag!

Ich hatte schon als Randgedanke daran gedacht mir ein improvisiertes Spektrometer zu bauen um mir genauer ansehen zu können was da passiert, aber natürlich könnte ein Monochromator noch nützlicher sein ... ich habe aktuell aber etwas Bedenken die Sache nicht zu sehr ausufern zu lassen.

Mein Dank gilt insbesondere für deine Beschreibung des Vorgehens, denn wie ich nicht hier, aber in meiner Vorstellung geschreiben habe bin ich theoretisch ganz gut in der Lage die Sache zu durchdenken (Physiker, arbeite auch mit Optik), aber mir fehlt jede praktische Erfahrung mit Fluoreszenz und auch bzgl. Mikroskopieren ist der Erfahrungsschatz sehr begrenzt. Also nochmal vielen Dank!.

Ich versuche mal ein Diagram mit LED-Spektren anzuhängen auf das ich gestoßen bin (die konkreten LED-Produkte des Herstellers kommen nicht in Frage): Das sieht doch nicht so schlecht aus, ...

Grüße, Peter

[Hannival]

@Hubert: unsere Anworten kamen parallel, in meinem Diagram ist genau so ein Exemplar mit Peak bei 525nm, wie du es beschrieben hast.

Gemeinerweise ist es in dem Spektralbereich bei 525nm um ca. Faktor 4 weniger spektrale Leistungsdichte als z.B. in Rot und ich vermute (ohne Beleg bislang), das ist Halbleiterphysik und nicht herstellerbedingt.

[Lupus]

Hallo Peter,

natürlich ist die spektrale Leistungsdichte materialbedingt. Dass bei Grün weniger als bei Rot angegeben wird ist aber egal, man kann nur das verwenden was man bekommt.
Hier ein Beispiel einer solchen LED, S. 11 zeigt das Emissionsspektrum. https://lumstatic.com/3o/cP/02fC4dKCrIzixL7kSw.pdf

Hubert

[Hannival]

Hallo Hubert,

du scheint dich ja mit LEDs gut auszukennen. Vielleicht kannst du mir in einem Punkt auf die Sprünge helfen.

Ist mein Plan eine passende Farb-LED als Lichtquelle gegenüber einer Weißlicht-LED zu bevorzugen eigentlich der richtige Weg? Mein Verständnis für weiße LEDs ist, dass sie entweder durch Mischung mehrerer Farb-LEDs entstehen oder durch UV-LEDs plus Phosphorschicht. Eine der Fragen welche ich mir stelle ist, mit was bekomme ich mehr Licht in den durch meinen Fluoreszenzwürfel definierten Spektralbereich? Meine Gedanken gingen in Richtung Farb-LED wegen weniger Strom, weniger Hitze abzuführen, weniger Störlicht, aber wenn ich nur die Helligkeit in meinem Spektralbereich betrachte, denkst du eine Weißlicht-LED könnte besser als eine Farb-LED sein?

Grüße, Peter

[Rene]

Hallo Peter, es sieht so aus, als ob der Zugang zu dem Artikel gerade geschlossen wurde, möglicherweise wegen des zunehmenden Verkehrs von hier aus? Nun, ich habe es immer noch in meiner Sammlung, daher ist es hiermit beigelegt.

Mit einer geeigneten LED und einer Fresnel-Linse kann die Fluoreszenzeinheit sehr klein gehalten werden. Mit einer Fresnellinse mit f=15mm kann eine LED problemlos in diesem Abstand angebracht werden, und die gesamte Einheit wird höchstens doppelt so groß wie der Fluoreszenzwürfel. Ich habe mehrere inverse Mikroskope mit UV-Fluoreszenz für DAPI- und Calcofluor-Färbung auf diese Weise ausgestattet. Ob das Gerät so hell wie eine Xenon- oder HBO-Lampe ist, spielt heutzutage keine Rolle mehr: Ich suche und fokussiere durch das Okular, schalte dann sofort die LED herunter und fahre mit der Kamera auf dem Bildschirm fort. Das erspart ein starkes Verblassen des Fluorochroms. Auf jeden Fall waren die "monochromen" LEDs, die ich vor mehr als 10 Jahren verwendet habe, mehr als stark genug für den visuellen Gebrauch (nach meiner Erinnerung 1-3 W).

Ich hoffe, dass Sie hier einige Ergebnisse Ihrer Arbeit sehen werden,
Grüße,
René

PS. In diesem Bereich hat eine Weißlicht-LED nur Nachteile gegenüber einer monochromen LED.
PS2. In dem Artikel wird auch ein Diffusor ("holographisch") verwendet. Ich selbst brauchte sie nicht, mit etwas Variation des Abstands der LED von der Fresnellinse bekam ich die Intensität gleichmäßig genug (visuell). Außerdem sind solche Diffusors etwa 20 Mal so teuer wie die Fresnellinse....

[Lupus]

Hallo Peter,

ich sehe bei der spektralen Leistungsdichte im gewünschten Wellenlängenbereich - auf die es ja bei einer engbandigeren Fluoreszenzanregung hauptsächlich ankommt - keinen Vorteil bei einer weißen LED. Man müsste sich das aber genauer ansehen, indem man die Datenblätter guter LEDs auswertet. Ich habe mich mit dieser speziellen Frage noch nicht beschäftigt. Das Problem ist dass meist nur der Lumen-Wert angegeben wird, der ist aber für rein physikalische Probleme absolut nicht aussagefähig weil er ein Maßstab für das Helligkeitsempfinden des menschlichen Auges ist. Die spektrale Augenempfindlichkeit wird hierbei berücksichtigt, und folglich rote oder blaue Wellenlängenbereiche abgewertet auch wenn sie in physikalischen Leistungseinheiten (Watt) hohe Werte zeigen.

Die vom mir verlinkte grüne LED weist nach Datenblatt eine Ausbeute von 118 lm/W aus, typische weiße LEDs in ähnlicher Größenordnung. Aber die Intensität von z.B. 525 nm liegt bei weißen LEDs oft bereits deutlich unter ihren typischen Emissionsmaxima bei 440 nm und (je nach LED-Farbtempertur) 580 nm, daher ist eine Abschätzung der spektralen Lichtleistung nicht ganz einfach.

Der Vorteil der Farb-LED ist auf jeden Fall, dass man nicht so viel Wärme abführen muss weil man kein Unnötiges Licht erzeugt das man sowieso herausfiltern muss. Außerdem hängen die Vor- und Nachteile auch von den Filterkurvenflanken ab, denn entscheidend für die detektierbare Fluoreszenz ist die Unterdrückung des Anregungslichtes.

Hubert

[wilfried48]

Hallo,

die Zeiss 7 Kanal Muiti LED Fluoreszenzleuchte verwendet zur Anregung von Cy3 einen LED Modul mit 555 nm. (siehe angehängte Zeiss Info)
Ob man die aber unbedingt braucht sei dahingestellt. 555 nm kann man auch mit der vorhandenen Weißlicht LED gut anregen. Die hat bei der Wellenlänge genügend Power.
Zumindest mit der Weißlicht LED am Zeiss Axioimager funktioniert Blau- und Grün-Anregung hervorragend.

Gruß
Wilfried

[Hannival]

Hallo,

zuerst mal sorry, für die lange Sendepause (Corona, Urlaub und dann war einige Zeit nicht viel zu berichten). Aber da ich hier wirklich sehr hilfreiche Informationen bekomme habe (danke nochmals), möchte ich das vorläufige Ergebnis / Fortschritte zu dem Thema berichten.

Mir fällt doch noch eine Frage mit Bezug zu LEDs ein und zwar zur Sicherheit meiner Augen: die LEDs kommen mit den entsprechenden Warnhinweisen und ich achte darauf nicht direkt in die LEDs zu sehen, aber wie ist es mit dem Lichtpunkt auf der Probe? Da muss ich teilweise schon länger und sehr fokussiert für Einstellungen hinsehen, ist das mit Farb-LEDs (1 Ampere) schon etwas bei dem ich vorsichtig sein sollte, bzw. ist das kritisch?

Fortschritte: Es ging längere Zeit nur auf Sparflamme voran, aber beim LED-Thema gibt es Entwicklungen.

Ich habe jetzt für DAPI, CFITC und Cy3 LEDs und Filtersätze, unten die technischen Daten,

Mir fällt es noch schwer zu beurteilen, ob das was ich sehe akzeptabel ist, aber vieleicht weiß ich mehr in einigen Wochen. Aktuell experimentiere ich an einem Autofluoreszenztarget das ursprünglich mal mit einem Zeiss-Mikroskop verkauft wurde. Und zumindest da macht mir Cy3 am meisten Kummer, da die Helligkeit für eine Kameraaufnahme grenzwertig ist.

Nochmal zum Mikroskop:

Es ist ein Eigenbau (aus Optik-Elementen, welche schon da waren)
Olympus Objektive 40x Planachromat PLN40X und 20x Fluorite UPLFLN20
Monochromkamera

Die LEDs und Filtersätze, alle LEDs betreibe ich mit 1 A, die DAPI-LED würde noch etwas mehr aushalten

DAPI
LED:                                   385nm
Anregungsfilter:                 390nm, Breite 18nm
Dichroitischer Spiegel:       416nm
Emissionsfilter:                  460nm, Breite 60nm

FITC
LED:                                   470nm
Anregungsfilter:                 475nm, Breite 35nm
Dichroitischer Spiegel:       499nm
Emissionsfilter:                  530nm, Breite 43nm

Cy3
LED:                                   530nm
Anregungsfilter:                 534nm, Breite 48nm
Dichroitischer Spiegel:       562nm
Emissionsfilter:                  591nm, Breite 49nm

Ok, so viel zum Stand, danke nochmal für die Tipps!

Grüße, Peter

[engineer]

Hallo Hannival, im Elektronikforum wird gerade Dasselbe diskutiert. Der dortige Frage will Oberflächen untersuchen, wie ich per PM erfuhr und sich ein Mikrospektrometer bauen - eines, was man offenbar nicht kaufen kann.

https://www.mikrocontroller.net/topic/553678#new

Ich hatte dazu auch einige Gedanken gepostet.

Um es zusammenzufassen, gibt es praktisch für alle Spektralbereiche sehr schmalbandige LEDs, mit denen man das Spektrum peu a peu ausleuchten kann. Ein derartiges System habe ich schon mal entwickelt, es handelt sich aber um eine "Nicht-Mikroskop-Applikation", wenngleich es in Richtung Pharma / Bio geht. Die Details kann ich hier nicht publizieren, spinne aber den Gedanken mal weiter:

Für ein Durchlichtsystem müsste man wahrscheinlich ein austauschbares Dioden-Array bauen, also kreisförmige Anordnungen von Leuchtdioden mit einem Diffusor, damit die gesamte Fläche beleuchtet ist. Eine Erweiterung wäre ein 45°-Spiegel von unten, den man drehen kann und der von mehreren solchen Anordnungen gleichzeitig angestrahlt wird, sagen wir 8 Stück aus jeweils 45°-Winkeln, von denen jeweils immer 1 an ist.

Für ein Auflichtsystem könnte es gelingen, mehrere Farben parallel aus größerer Distanz zu installieren, z.B. immer 3 Farben zusammen, mit z.B. 3-4 Aufsätzen. Dazu könnte man die klassischen LED-Zusatz-Beleuchtungen in Ring-Form mit passenden LEDs umbestücken und dann in einem Gang 3 Spektralfarben aufnehmen. Möglicherweise kann man das auch kombinieren.

Ich hatte für ein Stereo-Projekt schon mal sowas gebaut, dabei gingen dann einmal Lampen aus unterschiedlichen Richtungen an, was es der Software ermöglicht, die Tiefen im Bild zu messen. Ich war auch schon dabei, das auf Farbe umzubauen, wurde nur gerade durch private Umstände blockiert. Werde das aber wieder aufnehmen.