Ephitelzellen in Fluoreszenz AO

[Daniel Scheibenstock]

gleich folgen die Bilder des Mittagsexperiment ;-)

Ablauf:

Probe wurde mit Zahnstocher gewonnen und auf einem Obj.Tr. verstrichen.
neuer Zahnstocher wurde in 80% Essigsäure getaucht und mit dem Speichel gemischt.
Neuer zahnstocher wurde in AO (AO-Wassergemisch) getaucht und mit der Probe gemischt.

das ganze wird schon besser :-)

Liebe Grüße Daniel

[Daniel Scheibenstock]

Bilder:



Je ein bearbeitetes und eines direkt aus der Kamera. 10 neofluar und 40 x60

[Spectrum]

Hallo Fluorenzler,
Sehr interessant was sich hier entwickelt. Den Beitrag von Alexander mit den unterschiedlichen ph-Werten kannte ich noch gar nicht. Welche Farbstoffkonzentration hast du dort angewendet?
Ich habe 2 Tage frei und werde auch Testaufnahmen beisteuern.
Bereite gerade fixierte Ausstriche vor. Würde zunächst eine Versuchsreihe mit absteigenden Konzentration des AO anfertigen. Beginnend mit 0.04g auf 100ml Aqua bidest. Einmal am Ausstrich und einmal an der frischen Probe. Dann weiter in Reihe verdünnen um den Faktor 10.

Hier spielen so viele Faktoren eine Rolle:
1.ph-Wert
2.Farbstoffkonzentration
3.Einwirkzeit
4.Photobleaching
5.Zusammensetzung des Anregungslichts ("Breite" des Anregungslichts)/Filterkombination

Vielleicht können wir uns ja auch absprechen, bin für Vorschläge offen.
Grüße Holger

[Daniel Scheibenstock]

Hallo Holger,

Welche Methode verwendest du für die Fixierung?

Lg Daniel

Ps mit Fiji bin ich schon weiter. Habe mal einen Versuch gemacht mit deconvulation und ist auf jeden Fall spannend

[Spectrum]

Die Ergebnisse der Testreihe in Bezug auf die Konzentration sind fertig:

-Alle Bilder Ausschnitte unbearbeiteter  jpeg Dateien aus der Sony a6500.
-Fixer Weißabgleich
-Belichtungszeit 1/60sec
-ISO Automatik
-LED 467nm +-11nm.
-Objektiv Nikon Fluor 20, 0,75

Je ein Bildpaar eines frischen Präparats und eines Ausstrichs.
Das frische Präparat wurde aus Abstrichmaterial gewonnen. Abstrich aus meinem Mundraum, suspendiert in NaCl 0,9%.
0.05ml Suspension mit 0.05ml Acridinorangelösung vermischt.
2min Einwirkzeit.
Das ausgestrichene Präparat wurde aus eben dieser Suspension gewonnen. Bei 40° getrocknet, mit Ethanol fixiert. Im Anschluss in Aqua bidest gereinigt.
2min in Acridinorangelösung angefärbt. Dann in Aqua bidest für weitere 2min gespült.
Mit Deckglas zügig unter Auflichfluoreszenz fotografiert

[Spectrum]

Acridinorangelösung 0.04% (0.04g/100ml Aqua bidest):

Frischpräparat:

1/60 sec, ISO 2500
Ausstrich:

1/60sec, Iso1000

Da isse die Rotfärbung. Bakterien lassen sich bei dieser sehr hohen Konzentration und den sonstigen Bedingungen bereits zumindest bei dem Ausstrich gut erkennen. Aber eben Rot auf Rot.

[Spectrum]

Acridinorangelösung 0,0.04% (0,004g/100ml Aqua bidest):

Frischpräparat:

1/60sec, ISO 250
Ausstrich:

1/60sec, ISO 1640
Bei dieser Verdünnungsstufe werden Zytoplasma Zellkerne und Bakterien auch farblich gut differenziert.

[Spectrum]

Acridinorangelösung 0,0004% (0.004g/100ml Aqua bidest):

Frischpräparat:

1/60sec, ISO 3200
Ausstrich:

1/60sec, ISO 5000
Bei dieser Verdünnungsstufe erscheint das unbearbeitete Bild überwiegend grün. Auch die emittierte Lichtmenge nimmt ab.

[Spectrum]

Weiter verdünnt habe ich dann nicht mehr. Zwei Ausstriche habe ich noch. Ich könnte diese ja mal bei gleicher Verdünnung aber jeweils in leicht saurem und leicht alkalischem Bereich färben. Aber das hat Alexander ja schon recht anschaulich getan. Bin für Vorschläge offen.

Ausserdem noch ein paar allgemeine Beobachtungen:
-Der Unterschied zwischen frischem und fixierte Präparat war überraschender Weise nur gering.
-Bakterien sind nur auf einem kleinen Teil der Probe zu finden. Auf der Mehrzahl der Epithelzellen konnte ich keine entdecken.
-Bei größeren Zellverbänden im Frischpräparat sieht man deutlich, daß es eine ganze Weile dauert bis die Färbelösung ins Innere vordringen konnte. Das daraus resultierende Konzentrationsgefälle sieht dann so aus:

[Jakob_Wittmann]

Holger, das ist wirklich anschaulich. Danke fürs Zeigen und Deinen Einsatz!

Übrigens: Manche dieser Deiner Bilder haben einen sehr großen Anteil an Rot, wobei die Farbinformation des Grünanteils durch die Komplementärfarbe unsichtbar bleibt. Doch sie ist vorhanden. Nun stellt sich zwar die Frage, ob man beim Wegnehmen von Rotanteilen das Bild viel zu stark manipuliert oder nicht.

Jedenfalls ist es vielleicht durchaus interessant, zu sehen wie das Bild eben bei Dämpfung von Rot aussieht. Zusätzlich habe ich noch eine Deconvolution mit einer errechneten PSF versucht und auch sonst das Bild etwas bearbeitet.

Wenn es Dir lieber ist, dass ich das Bild wieder entferne, Holger: Bitte sagen, ist überhaupt kein Problem.

Liebe Grüße


Jakob

[Spectrum]

Hallo,
Grundsätzlich bitte immer gerne mein Bildmaterial weiterverarbeiten. (Hab ich auch extra in meine Signatur geschrieben). Genau davon kann man doch lernen. Ausserdem ist das hier Daniels Faden. Ich persönlich finde das total super wie hier jeder was zum Thema beiträgt.
LG Holger

[Aljoscha]

Welche Farbstoffkonzentration hast du dort angewendet?

Hallo Holger,

Ich verwende eine Gebrauchslösung 0,001 % und ich fixiere die Proben vor dem Färben.

Viele Grüße

Alexander

[Daniel Scheibenstock]

@holger: das ist nicht mein Faden sondern unser aller Faden. Wie sagen die Engländer? The more the merrier !

Ich werde morgen mal eine Reinkultur (Bakterien) färben. Dann können wir vergleichen wie das aussieht. Ich habe bei den großen Zellkernen irgend wie das Gefühl das sie das ganze gern etwas überstrahlen. Man sieht es m.E. Gut bei Jakobs Beitrag (das deconvulierte)

[Spectrum]

Da haben die Engländer wohl recht😄👍
Ich habe jetzt noch die beiden letzten Ausstriche gefärbt und dabei etwas überraschendes gefunden. Der erste wurde mit 0.004% Acridinorangelösung angefärbt, mit einem ca1% igem Anteil an Essigsäure:

Da hätte ich mir mehr erhofft.

Für das letzte Bild habe ich mir aus Ermangelung einer Pufferlösung mit "Emser Inhalationslösung" beholfen.
Laut Hersteller ist diese leicht basisch (ph 8-10). Welchen ph Wert die Mischung mit der 0,004%igen Acridinlösung hatte kann ich nicht genau sagen, aber das Ergebnis überzeugt:

Helle Fluoreszenz, klar differenzierte Zellkerne und rot gefärbte Bakterien.
Könnte es sein das sich das AO unter den nur leicht basischen Bedingungen an den Bakterien besonders gut ablagert? Und wenn ja, warum?
Ganz schon vertrackt dieses Acridinorange...🤔

[Aljoscha]

Hallo,

Schichten aus mehreren Lagen Zellen erschweren die Beobachtung. Daher empfiehlt es sich, die Speichelprobe mit Ringerlösung oder PBS zu verdünnen und dann auszustreichen. Einzeln liegende Zellen ergeben sehr viel bessere Bilder als mehrlagige Zellklumpen.

Viele Grüße

Alexander