Ephitelzellen in Fluoreszenz AO

[Daniel Scheibenstock]

Hi zusammen,

ich wollte euch ein paar Aufnahmen meiner Epithelzellen aus dem Mundraum zeigen. Die Zellen sind mit Acridinorange gefärbt, und ich habe sie mit einem selbstgebauten Xenon-Brenner sowie einem Zeiss IM35 Mikroskop aufgenommen.

Für die, die mit Acridinorange nicht so vertraut sind: Acridinorange färbt verschiedene Strukturen in unterschiedlichen Farben, was bei der Analyse der Zellen und Bakterien hilfreich ist. In diesen Aufnahmen erscheinen die Zellkerne der Epithelzellen in einem kräftigen Grün, während bakterielle DNA in leuchtendem Orange bis Rot dargestellt wird. So lassen sich die Bakterien deutlich von den Körperzellen abgrenzen.

Zusätzlich habe ich noch eine Hellfeldaufnahme hinzugefügt, um einen besseren Vergleich zu ermöglichen und die Strukturen im Kontext zu sehen.

Ich freue mich auf euer Feedback und vielleicht Tipps zur Optimierung der Aufnahmen!

Liebe Grüße Daniel

[Spectrum]

Die Bilder sehen doch schon ganz gut aus. Vor allem das letzte Bild. Du hast den Zeiss Filtersatz 09 verwendet, richtig?
Schön schwarzer Hintergrund, wurde das nachträglich bearbeitet? Falls ja, wäre die Originalaufnahme noch interessant, zwecks Tips.
Die roten Punkte auf dem letzten Bild dürften wohl Bakterien sein.
Was die Effizienz angeht dürfte mit 1/4 sec bei Iso8000 eventuell noch etwas Luft nach oben sein. Versuch doch mal anhand einer Probe mit frischem Chlorophyll (Moosblättchen), ob du mit einer Justage der Beleuchtung noch kürzere Belichtungen erreichen kannst.
Was das Acridinorange angeht, kann man die Konzentration hier höher ansetzen  als bei lebenden Einzellern. Auch die Einwirkzeit und der ph-Wert spielen beim Ergebnis eine Rolle. Versuch die Färbelösung einmal mit Essigsäure (1%) anzusäuern.
Ebenfalls denkbar wäre bei Buccalzellen auch das Fixieren und Anfärben eines Ausstrichs. Suche im Forum mal nach "Bakterien in der Fluoreszenzfärbung" da beschreibt Ralf Feller so ein Verfahren.
Und bei Blauanregung bin ich persönlich überzeugt, das eine LED Beleuchtung mit einer geeigneten royalblauen LED nochmals eine deutliche Leistungssteigerung bringt. Einen Halter für den Kürbis anzufertigen dürfte relativ einfach umzusetzen sein.
Ansonsten sieht das, wie schon gesagt, ganz ok aus.
Grüße Holger

[Daniel Scheibenstock]

Der Filter müsste der 9er sein ext.450-490. Das war auf dem inversen da sind die Objektive stellenweise recht dunkel. Am Universal habe ich schon eine neofluar Satz zusammen getragen.

Danke für deine Ideen ☺️

[Spectrum]

Wo du es gerade ansprichst, das Objektiv wäre auch noch interessant zu erfahren. Das spielt bei der Auflichtfluorestenz nämlich gleich doppelt eine Rolle. Zum einen fungiert es ja als Kondensor und projiziert das Anregungslicht auf die Probe, zum anderen sammelt es das zurückgestrahlte Licht auch wieder ein. Was meinst du mit "dunkel"? Was steht denn genau auf dem für die Aufnahmen verwendeten Objektiv drauf. (am besten machst du mal ein Foto).
Neofluare sind genau die Objektivklasse die Zeiss für die Fluoreszenzmikroskopie vorgesehen hat. Eine gute Wahl, die v.a. auch für den kurzwelligen Bereich besser geeignet sind.
Versuch doch einmal Vergleichsaufnahmen zwischen einem Neofluar und einem der Objektive an dem inversen Stativ zu machen. Natürlich bei gleicher Vergrößerung.
Und wenn du aussagekräftige Tips suchst, solltest du auch die unbearbeiteten Originalbider mit Angabe von ISO und Belichtungszeit einstellen. Sonst wird eine Aussage dazu schwierig.
LG Holger

[Daniel Scheibenstock]

Hier Mal ein unbearbeitetes bsp. Das objetive ist das speziellem Zeiss West 40 für Petrischalen mit Korrektur ring

[Daniel Scheibenstock]

Ich seh den Unterschied schon am IM35 da habe ich ein 10 neofluar drauf

[Daniel Scheibenstock]

Es is t ein Plan 40x60

[Spectrum]

Ok, das zuletzt gezeigte Bild sieht bis auf die Unterbelichtung schon recht gut aus.
Was mir aufgefallen ist: Es wurde mit 1/20sec aufgenommen, das gleiche Motiv aus der ersten Bilderserie aber mit einer längeren Belichtungszeit von 1/4sec.
Das wäre dann mein nächster Tip. Versuch einmal mit verschiedenen Belichtungszeiten das Bildergebnis zu optimieren. So hell wie möglich belichten ohne das Details überstrahlt werden, ist das Ziel.
Das Automatikprogramm deiner Kamera ist für Fluoreszenzaufnahmen völlig ungeeignet. Stell am besten alles manuell ein. Deine Sony ist wegen ihres guten Rahschverhaltens sehr gut bei hohen ISO Werten nutzbar. ISO 8000 ist da noch völlig ok, je nachdem auch mehr. Aber bei Motiven die sich nicht bewegen ist eine niedrigere ISO doch die bessere Wahl. Bei beweglichen Motiven mußt du dann natürlich doch auch die Belichtungszeit mitbeachten,  damit es keine Bewegungsunschärfe gibt.
Bei unbewegten Motiven kannst du aber die Belichtungszeit so lange wählen bis es passt.
Viel Erfolg
* Hast du eigentlich inzwischen mal geschaut ob dein Aufbau tatsächlich auch UV dicht ist? Ich hatte dir ja den Rat mit den photochromen Brillengläsern gegeben. Falls du die nicht verfügbar hast giebt es beim Versandhaus mit "A" auch sogenannte UV-Testkarten/Aufkleber. Ich meine die welche sich lila verfärben.
Kosten <5€. Damit kannst du deine Xenon Lampe und die Stelle an der sich der Objektträger befindet und der Lichtaustritt am Okular auch auf unbeabsichtigt Lecks "abchecken".

[Spectrum]

Vergleichen lassen sich nur zwei Objektive mit gleicher Vergrößerung.
Also ein 40er Plan mit einem 40er Neofluar.

[Jakob_Wittmann]

Hallo zusammen,

lieber Daniel, gefällt mir gut. Ich habe mit Acridinorange Ähnliches versucht, aber meine Ergebnisse zeigten keine Rotfärbungen von Bakterien.

Möglicherweise passte die Verdünnung nicht. Man liest auch (teilweise) deutlich unterschiedliche Rezepturen die Konzentration von Acridinorange in Aqua dest. angehend.

Noch wahrscheinlicher ist Meiner Ansicht nach ein pH-Wert, der für eine rötliche Färbung von an DNA-reichen Strukturen nicht gepasst hat, denn dieser, der pH-Wert, kann sehr unterschiedliche Ergebnisse hervorrufen.

Zu diesem Thema hat Alexander (Aljoscha) einen sehr lesenswerten Beitrag verfasst:

https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=45777.msg337604#msg337604

Du hast mich nun daran erinnert, so eine Versuchsreihe nochmals zu probieren. Dabei werde ich es mit unterschiedlich eingestellten pH versuchen (mit Sörensen Puffer). Vielleicht gehe ich auch mit der Konzentration auf 1:10000 hoch.


Bei solchen Bildern sicher auch ein mögliches Thema:

Zur Verbesserung des Kontrasts und der Schärfe wird bekanntlich in der Fluoreszenzmikroskopie nicht selten mit Deconvolution gearbeitet.

Dabei entsteht (für mich) das Problem: ,,Wie komme ich zu der PSF (point spread function) meines genutzten Objektivs?"

Dafür genutzte Methoden mit fluoreszierenden ,,Micro Beads" in der Größe von ca 1 bis 2 µm zur Bestimmung der Beugungsscheibchen sind ausgesprochen kostspielig. Und: Eine synthetisch errechnete PSF ist zu einem gewissen Teil Glückssache.

Wenigstens existiert mit ImageJ eine kostenfreie Software, die auch so etwas ermöglicht. Das vorkonfigurierte Paket ,,Fiji" ist dafür besonders anzuraten.

ImageJ ist nicht unbedingt eine intuitiv zu bedienende Software, aber es existieren Tutorials.

Ach ja, ich füge Bilder meines Versuchs bei, der leider keine rot gehaltenen Bakterien zeigt. Das muss sich ändern ...   


Liebe Grüße


Jakob

[Daniel Scheibenstock]

Vergleichen lassen sich nur zwei Objektive mit gleicher Vergrößerung.
Also ein 40er Plan mit einem 40er Neofluar.

Ich habe mal mit normalem deckglas und dem Neofluar das 40er verglichen schon etwas besser als das LWD40. Probleme machen am meisten das plan 2,5 und das LWD20

[Daniel Scheibenstock]

Das Automatikprogramm deiner Kamera ist für Fluoreszenzaufnahmen völlig ungeeignet.

* Hast du eigentlich inzwischen mal geschaut ob dein Aufbau tatsächlich auch UV dicht ist? Ich hatte dir ja den Rat

Ich Fotografiere am Mikroskop immer Manuell da ja die Automatik wegen der fehlenden Blendensteuerung, meiner bevorzugten Belichtungmessung (spot) eh nur noch Blödsinn macht 

ich habe das tatsächlich Ignoriert da mein Filter frisch vom Fachhändler ist, das UV Schutzrohr an der Xenon nicht demontiert wurde und ich ja eventuell eh auf LED umbauen werde, aber dsa mit den aufkleber werde ich am Universal mit der UV led eh machen müssen (da habe ich dann tatsächlich repekt!)

liebe Grüße Daniel

[Daniel Scheibenstock]

Hallo Jakob,

danke für dein Tipp mit Fiji, das hat mich jetzt sehr beschäftigt..... .....ohne Ergebnis
ich bleib dran 

Deine Fotos errinern mich an meine Probe nach etwa 30 minuten. die besten Kontraste hatte ich kurz nach dem Färben, die ergebnisse von Alexander sind auch intressant, meine Probe war nicht fixiert und der pH wert neutral, ich habe heute Mittag vor mal das ganze anzusäuern, ich werde später berichten ;-)

liebe Grüße  Daniel

[Aljoscha]

Probleme machen am meisten das plan 2,5 und das LWD20

Hallo Daniel,

Das ist so. Die Lichtausbeute von Objektiven bei Auflichtfluoreszenz kann mit der Formel NA^4/Vergrößerung^2 beschrieben werden. die NA geht also mit der 4. Potenz ein. Lichtschwache Objektive sind nicht gut geeignet. Du verwendest ein 2.5x/0.08. Im Vergleich liefert das 5x/0.25, das ich einsetze 25x so viel Fluoreszenzlicht.

Viele Grüße

Alexander

[purkinje]

Hallo Alexander,
schön auf den Punkt gebracht, oder wie es bei den Fluoreszenzlern so schön heißt: sowenig Fluorchrom wie nötig (wegen des unspez. Hintergrundes) und soviel Apertur wie möglich, deshalb gibt es ja 10er, 25er und 40er W bzw. Öl-Immersionen mit hoher Apertur (leider rar und teuer)
 
Beste Grüße Stefan