Ephitelzellen in Fluoreszenz AO

[Spectrum]

Ja, das stimmt. Deshalb habe ich die Probe auch verdünnt (in meinem Fall mit NaCl 0,9% anstatt Ringer) und mittels feiner Pipette vermischt. Trotzdem bleiben an manchen Stellen auch noch "Klumpen" aus Zellverbänden bestehen.

[Jürgen H.]

Guten Morgen zusammen:

,,The outstanding characteristic of acridine orange is its pronounced metachromasia. This is a consequence of the " con.eentration effect" (S t r u gget 1949). The mldissociated acridine orange molecule presents green fluorescence. However, depending on pH, acridine orange becomes dissociated (completely between pH = .65 to 6 0, and still 85%o at pH = 8: el. Sehiimmelfeder, Krogh and Ebsehner 1958). The cation is strongly metachromatic: Concentrated solutions (higher than 5 X 10-3M) fluoresce red, weaker solutions (less than 10 -4 M) green. The color change is based upon the formation of dimers and polymers of the dye occurring in higher concentrations."

Zitat aus:
Bertalanffy, L. Acridine orange fluorescence in cell physiology, cytochemistry and medicine. Protoplasma 57, 51–83 (1963)

Viele Grüße

Jürgen

[Spectrum]

Morgen Jürgen,
Die zitierte Textstelle erklärt sehr gut die Beobachtung.
Die rote Anfärbung der aufsitzenden Bakterien, die bevorzugt in leicht basische Millieu,  oder bei eher hohen Konzentrationen auftritt, erklärt sich dann wohl mit einer erhöhten H+ Konzentration an der Membran der Bakterien. (Stichwort "elektrogene Pumpe"). Ist das umgebende Medium selbst auch leicht sauer fehlt das H+ Gefälle um dort bevorzugt Farbstoff anzulagern. Dementsprechend bleiben die Bakterien deshalb in saurem Milieu auch grün, richtig?
Grüße Holger

[purkinje]

Hallo Holger,
der bathochrome Effekt ("Rot-Verschiebung") tritt durch die lokale, sehr kleinräumige, auf molekularer Ebene auftretende Konzentrationserhöhung und Überlappung der Moleküle auf.
Damit eng verknüpft ist ob AO als Mono-, Oligo- oder Polymer vorliegt. Das ist wiederum beeinflusst von AO-Konzentration, Lösungsmittel /Puffer und Aufnahme in Zelle und Zellmilieu sowie der Struktur an die sich AO anlagert.
So führt u.U. Anlagerung an einzelsträngige Nukleinsäuren (einzelsträngige RNA oder 'aufgebrochene'  DNA) eher zu orange bis rot, an Doppelsträngen zu grün, dies ist jedoch, wie festgestellt sehr Protokoll-abhängig!
Als Ergänzung zu der o.g. Literatur:Updating Ortho- and Metachromatic Acridine Orange Fluorescence in Cytochemical Chromosome Staining... v.a Abschnitt 3.
und nicht nur für die Ciliatenfreunde ein Hinweis auf
Interpretation der Acridinorange-Färbung von Ciliaten (Ciliophora) des Süßwassers und des Bodens von Thilo Bauer
Beste Grüße Stefan

[Spectrum]

Hallo Stefan,
Der Artikel von Juan C. Stockert und Alfonso Blázquez-Castro ist ja eine wahre Fundgrube! Tausend Dank dafür.
Den Artikel von Thilo Bauer kenne ich schon. Damit ging es bei mir mit dem Hobby, insbesondere mit dem Interesse für Fluoreszenz erst so richtig los. Hochinteressant!
An dieser Stelle würde ich übrigens gerne auch auf das, ich nenne es einmal Schwesterforum, hinweisen.
Momentan hängt der Fortbestand des z.Z. noch von Thilo Bauer geführten "Tümpler-Forums" wohl am seidenen Faden.
Ich persönlich empfand dieses Forum immer als tolle Ergänzung zu dem Forum hier.
Vielleicht findet sich ja doch noch eine Lösung.
Grüße Holger

[Daniel Scheibenstock]

Hi Zusammen,

ich habe weiter getestet

Leider ging einiges schief und ich kann nur mit wenigen Bildern Dokumentieren:


Ich habe die Ausstriche frisch in selber hergestellten Puffer verdünnt. Dieser bestand aus 0,9% NaCl und wurde im pH wert eingestellt.

Leider war der Kamera Akku leer und bis wieder Strom da war schon eine Veränderung der Probe feststellbar :-(

Liebe Grüße Daniel

[Spectrum]

Dein Ergebnis passt ja gut ins Gesamtbild.👍
Schöne Bildergebnisse.
Grüße Holger

P.s. Handschuhe? (Sorry, kann's nicht lassen)

[Daniel Scheibenstock]

Ja Handschuhe hab ich schon da sehe hier aber nicht wirklich die Notwendigkeit. Das AO ist schon verdünnt, und wurde mit einem Zahnstocher aufgenommen und in die Probe eingebracht. Wenn das fahrlässig ist bitte um Hinweis an mich :-)

Ich werde den Versuch nochmals wiederholen. Und dann wahrscheinlich mit deckglas und umgekehrtem Objektträger, mal das 40er Neofluar einsetzen.

Schönen Sonntag an alle Kollegen, Daniel

[Spectrum]

Naja, vielleicht bin ich eher von der übervorsichtigen Sorte, du hast recht die Lösung ist recht stark verdünnt und so akut giftig ist das AO jetzt nicht, aber es interkaliert halt mit DNA. Deshalb ist eine Genschädigung nicht auszuschließen.
Und Handschuhe tragen tut ja nicht weh. Genauso wie eine wasserfeste Unterlage. Das eingesparten Krebsrisiko ist mit einem Steak vom Grill besser angelegt.
Gutgemeinte Grüße Holger

[Carsten Wieczorrek]

Hallo,
mit großem Interesse bin ich diesem Faden gefolgt und habe die letzten Abende viele Stunden mit Experimenten verbracht, um das hier gezeigte nachzuvollziehen. Ich erlaube mir daher mal, zwei Bilder beizutragen.

Das Präparat ist ein Mundhölenausstrich. Fixierung: Hitzefixierung (10 Minuten am Rand des Kaminofens). Verdünnte Acridinorange-Lösung mit Essigsäure auf pH 5 gebracht. 10 Minuten Einwirkzeit. Beleuchtung: LED 3W 450 nm (die Fluoreszenz war hier stärker, als bei 430 nm).
Filterwürfel CZJ (schwarze Serie, steht nur 450 drauf, ist ein Anregungsfilter B422 und ein Sperrfilter G245 verbaut). Zusätzlich unter dem Bino ein G242. Belichtung 1 s bei 1000 ASA.

Schönen Abend,
Carsten

[Peter V.]

Hallo,
vor ein paar Wochen habe ich mal mit AO ein paar Mundschleimhautzellen behandelt. Unwissenschaftlicher gehts nicht: Etwas Abstrichmaterial von der Wange auf einen Objektträger gebarcht. Nicht ausgestrichen. Etwas AO-Lösung "frei Schnauze" verdünnt, ein Tropfen darauf und dann ein Decklgas aufgelegt. Normale 100 Watt Halogenleuchte, Leica Filtersatz I3.

Herzliche Grüße
Peter

[Daniel Scheibenstock]

Hallo Carsten, Hallo Peter,

2 tolle Beiträge. Ich finde an Carstens Fluo2 Bild toll die differenzierten Bakterien. Good Job 🙂👍 @Peter für frei Schnauze sieht das aber schon beachtlich gut aus😉

[Spectrum]

Hallo Carsten,
Toller Farbkontrast. Und der Hintergrund tiefschwarz. Wie hast du das hingekriegt? War das Bild von Anfang an schon so?
Hallo Peter,
Die Barch-Methode hab ich auch gleich mal ausprobiert, und mich nochmal in das Reich der ästhetischen Mundfäule begeben.
0.04% AO  (also recht stark konzentriert) mittels Durchziehen unterm Deckglas ein Konzentrationsgefälle hergestellt und dann nach interessanten Stellen gesucht:
Die Bilder sind mit einem Nikon Fluor 40/1,30 Öl an meinem Fluo-Frankenstein entstanden. Bildausschnitt und nachbearbeitet.
Grüße

[Carsten Wieczorrek]

Guten Morgen.
@Holger: ja, der Hintergrund ist so dunkel. Sieht auch im Okular so aus, auch die Bakterien. Für eine geringe Hintergrundfluoreszenz sollte das Präparat von überschüssigem AO frei gespült werden.
Grüße
Carsten

[Jakob_Wittmann]

Hallo liebe Runde,

etwas spät, aber doch einige Ergebnisse von mir.

Wobei ich bitte anmerken möchte, dass ich Probleme hatte, die Epifluoreszenz-Einrichtung (IV FL) für ZEISS STANDARD Typen ordentlich zu zentrieren, da die Verbindung mit dem Mikroskop sehr wackelig war. So etwas wirkt sich durch den Abstand zum Tubus weiter hinten bei der Beleuchtung merkbar aus (eine 3 Watt Cree, die in ein ZEISS Lampenhaus 60 Watt eingebaut wurde).
Gewissermaßen ein ,,Durchhängen" und zu wenig Licht.

Die AO-Mischung mit Aqua dest. war nach Schätzung konzentriert. Der pH auf 6,2 (Messstreifchen) eingestellt. Die Belichtung unbequem lange dauernd (40 Sekunden).

Aber seht bitte selbst ...  


Liebe Grüße


Jakob