Arbeitsabstand bei Immersionsobjektiven

[reblaus]

Anlässlich einer etwas wirren Diskussion im Mikro-Markt möchte ich einschlägige Experten bitten zu einer Klarstellung beizutragen.
   Ich verwende z.B. ein älteres Zeiss PlanApo 100x/1,40 bei dem der Arbeitsabstand mit 0,09 mm, also 90 µm angegeben wird.
   Bei Untersuchung von Diatomeenpräparaten unter Deckgläsern der üblichen Dicke (0,17 mm, meist etwas dünner) gibt es kaum Probleme auch etwas "dickere" Exemplare durchzufokussieren und das Objektiv danach auszuschwenken.
   Zwischen Frontlinse und Fokusebene ist dann nur
(1.) Öl mit ähnlichem B.index wie Glas,
(2.) Deckglas,
(3.) wenn man tiefer fokussiert noch m.o.w.Einbettungsmittel.

Vielen Dank für Aufklärung!

Rolf
 

[reblaus]

Bitte um Verschiebung in die richtige Rubrik!

Rolf

[Rene]

That's right, but what's your question?

Best, René

[Lupus]

Hallo Rolf,

der Arbeitsabstand bezieht sich auf den "bestimmungsgemäßen Betrieb". Bei Objektiven für 0.17 mm Deckglas also auf den Abstand über dem Deckglas.

Hubert

[jochen53]

Ich kann nicht erkennen, was jertzt genau Deine Frage ist. Hat das Objektiv denn eine Deckglas-Korrektur?
Jochen

[reblaus]

Nein - hat keine Deckglaskorrektur. Gibt es das überhaupt bei 100er Imm.objektiven?

MeineFrage wäre: Wenn ich das Objektiv nun um 0,08 mm = 80 µm senke: geht dann meine Fokusebene unterhalb des Deckglases ebenfalls um 80 µm tiefer, d.h. kann ich einen am Deckglas fixierten Organismus (z.B. dickes Diatomeenskelett oder eingeklemmten Protisten) durchfokussieren? Oder existieren optische Faktoren, welche diesen Bereich beeinflussen?

Vielen Dank für Infos!

Rolf

[Carsten Wieczorrek]

Hallo,
irgendwie habe ich das Gefühl, dass der Begriff Deckglaskorrektur nicht klar hier heraus kommt. Eine Deckglas Korrektur ist für mich ein Drehring am Objektiv. Ich kenne 100er, die so etwas haben, aber die haben eine Appertur von kleiner 1. Die Frage ist doch, ob das Objektiv für Deckgläser gerechnet ist oder nicht. Also ob es /0,17 oder /0 Objektive sind. Oder stehe ich hier völlig auf dem Schlauch?
Grüße
Carsten

[Rene]

Nein - hat keine Deckglaskorrektur. Gibt es das überhaupt bei 100er Imm.objektiven?
 kann ich einen am Deckglas fixierten Organismus (z.B. dickes Diatomeenskelett oder eingeklemmten Protisten) durchfokussieren? Oder existieren optische Faktoren, welche diesen Bereich beeinflussen?

When it is homogenous, ie in Canada Balsam the micrometer works as specified. With a diatom slide in Naphrax spherical abberation quickly builds up deeper in the medium. I've seen coverslip thickness correction on oil objectives for TIRF, and temperature correction also. Would be interesting what range these temperature correction collars covers in view of coverslip thickness.

I seem to remember discussions about differences in dispersion between glass and oil, but I'm pretty sure I wouldn't be able to see it myself in diffraction limited conditions.

Best, René

[reblaus]

Tanks a lot for these infos - that's what I wanted to learn!
Kind regards
Rolf

[Rene]

I suppose you can play around with glycerin as immersion medium in different concentrations as to correct for deep embedded diatoms, but never found the hyperfocus to start evaluating that idea 

Best, René

[Stevie]

Anlässlich einer etwas wirren Diskussion im Mikro-Markt möchte ich einschlägige Experten bitten zu einer Klarstellung beizutragen.
   Ich verwende z.B. ein älteres Zeiss PlanApo 100x/1,40 bei dem der Arbeitsabstand mit 0,09 mm, also 90 µm angegeben wird.
   Bei Untersuchung von Diatomeenpräparaten unter Deckgläsern der üblichen Dicke (0,17 mm, meist etwas dünner) gibt es kaum Probleme auch etwas "dickere" Exemplare durchzufokussieren und das Objektiv danach auszuschwenken.
   Zwischen Frontlinse und Fokusebene ist dann nur
(1.) Öl mit ähnlichem B.index wie Glas,
(2.) Deckglas,
(3.) wenn man tiefer fokussiert noch m.o.w.Einbettungsmittel.

Vielen Dank für Aufklärung!

Rolf

Ich vermute, die Frage war wohl etwas ungeschickt formuliert. Mir scheint, es ging darum, bis zu welchem Punkt der Arbeitsabstand eines Objektivs gemessen wird, und das hat Hubert (Lupus) im Prinzip ganz richtig beantwortet. Bei Objektiven, die für ein Deckglas bestimmter Dicke gerechnet sind, misst man von Objektivunterkante bis (Oberkante) des Deckglas (sofern auf die Deckglasunterkante fokussiert ist) und für Objektive, die ohne Deckglas gerechnet sind, von Objektivunterkante bis zur Fokusebene.

Oder anders ausgedruckt: Der Arbeitsabstand gibt an, wie tief in ein Präparat maximal hinein fokussiert werden kann, ohne dass das Objektiv an Präparat oder Deckglas anstößt.

[Rawfoto]

Guten Abend,

Das Thema ist im Mikromarkt nicht an der richtigen Stelle, daher wurde es von mir verschoben.

Liebe Grüße

Gerhard

[Stevie]

Nein - hat keine Deckglaskorrektur. Gibt es das überhaupt bei 100er Imm.objektiven?
 kann ich einen am Deckglas fixierten Organismus (z.B. dickes Diatomeenskelett oder eingeklemmten Protisten) durchfokussieren? Oder existieren optische Faktoren, welche diesen Bereich beeinflussen?

When it is homogenous, ie in Canada Balsam the micrometer works as specified. With a diatom slide in Naphrax spherical abberation quickly builds up deeper in the medium. I've seen coverslip thickness correction on oil objectives for TIRF, and temperature correction also. Would be interesting what range these temperature correction collars covers in view of coverslip thickness.

I seem to remember discussions about differences in dispersion between glass and oil, but I'm pretty sure I wouldn't be able to see it myself in diffraction limited conditions.

Best, René

Vielleicht dazu noch eine Ergänzung aus dem Live-Cell-Imaging-Bereich:

Zur Durchmusterung (z-stacking) und 3D-Rekonstruktion von Zellspheroidkulturen auf oder in Agarose-Gelen (mittels invertierter Konfokalmikroskope) haben wir bevorzugt spezielle Wasserimmersionsobjektive benutzt. Der Brechungsindex von Wasser (ca. 1,33) ist deutlich kleiner als der von Öl (1,518). Unter diesem Gesichtspunkt sind Wasserimmersionsobjektive besser für wässrige Proben geeignet, da ein gleichmäßigerer optischer Pfad entsteht und optische Fehler minimiert werden. Typische Kulturmedien haben einen Brechungsindex wie Wasser und selbst der Brechungsindex von typischen (1 bis 4 %[w/v]igen) Agarose-Gelen (1,33-1,34) liegt sehr nahe an dem von Wasser. Gerade bei dicken oder 3-dimensionalen Proben wie multizellulären Spheroidkulturen verursacht Immersionsöl wegen des anderen Brechungsindex in zunehmender Tiefe zunehmend Bildverzerrungen, während Wasserimmersion durch ihren passenden Brechungsindex diese Fehler minimiert.

Um auf Rolfs Frage zurückzukommen:
Ja, du kannst je nach Arbeitsabstand des Objektivs in eine "dicke" (und weitestgehend transparente) Probe mehr oder weniger tief hinein fokussieren. Wie René sagt, können dir Präparatstrukturen in höheren Ebenen im wahrsten Sinne des Wortes die Sicht auf die Fokusebene trüben. Hier spielt auch die Schärfentiefe der Objektive eine wichtige Rolle. Eine geringere Schärfentiefe erlaubt es, aus dicken Proben nur dünnere "schärfere" Schichten "herauszuschneiden" und abzubilden. Dadurch wird das Bild von unscharfen Anteilen aus anderen Ebenen befreit, was den Kontrast verbessert. Die Schärfentiefe ist umgekehrt proportional zum Quadrat der NA, weshalb eine hohe NA bzw. hohe Objektivauflösung mit geringer Schärfentiefe einhergeht. (Leider geht eine hohe NA konstruktionsbedingt mit einem geringeren Arbeitsabstand einher, so dass man weniger tief in die Probe fokussieren kann.)

Der herkömmlichen Mikroskopie sind hier offensichtliche Grenzen gesetzt. Möchte man beispielsweise, wie oben erwähnt, hochauflösende Bilder in mehreren Präparatebenen aufnehmen, um dann womöglich noch im Computer 3-dimensionale Modelle zu erzeugen, reicht ein Objektiv mit hoher NA (und hinreichendem Arbeitsabstand) nicht mehr aus. Hier setzt beispielsweise die Konfokalmikroskopie an, bei die Probe nur punktweise mit einem fokussierten Laser beleuchtet wird. Zusätzlich dient eine Lochblende (Pinhole) vor dem Detektor dazu, Lichtanteile (Streulicht) aus fokusfernen Schichten zu blockieren. Je kleiner die Lochblende, desto höher die axiale (in der Tiefe) Auflösung (allerdings auf Kosten der Bildhelligkeit). Der Laserspot wird über die Probe gerastert, Linie für Linie, Schicht für Schicht. Und die detektierten Signale werden am Computer zum Bild zusammengesetzt.

PS: Danke Gerhard! 👍

[reblaus]

Hallo -

@Gerhard - ebenfalls vielen Dank für die Korrektur meines Platzierungsfehlers, den ich zwar sofort nach Eröffnung des threads erkannt hatte aber leider nicht mehr korrigieren konnte.

@Stevie - Dir besonderen Dank für Deine Bemühungen meinen mangelnden Kenntnissen Abhilfe zu schaffen, sogar bis in die Tiefen der Konfokalmikroskopie!

und Dank an alle, die trotz meines missglückten Eröffnungsbeitrags die Geduld nicht verloren und ihre wertvolle Zeit in den thread investiert haben!

Rolf