Autor Thema: HISTOLOGIE: Markscheiden Fixiert in Formalin und Glutaraldehyd  (Gelesen 20347 mal)

Holger Adelmann

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Re: HISTOLOGIE: Markscheiden Fixiert in Formalin und Glutaraldehyd
« Antwort #15 am: September 19, 2013, 18:02:50 Nachmittag »
Tolle Bilder Ronald.
Ich gehe ganz konform mit Carsten was die Qualität und den hohen Standard auch Deiner Fixierung angeht.
Ja, bei Nervengewebe solltest Du mit Plasmaexpandern arbeiten um die Gewebe-Osmolalität möglichst gut zu treffen, sonst hast Du entweder Schrumpfungen oder 'Pseudoräume' durch hypotones 'Aufquellen' des Gewebes.

Statt Plasmaexpandern kannst Du auch mal 2-5% Saccharose (Haushaltszucker) in der Fixierlösung experimentieren.

Manche Strukturen werden im EM auch mit Kaliumpermanganat fixiert - ich glaube das waren Ribosomen, bin mir aber nicht absolut sicher....

Bei der Osmierung ist weiterhin zu beachten, dass das OsO4 nur sehr schlecht ins Gewebe eindringt, da es sich ja sofort an die ersten erreichbaren Lipide bindet. Obwohl Du fuer Deine Feingewebsuntersuchungen sicher nur sehr kleine Stuecke fixierst, wirst Du dennoch bei der Immersionsfixierung hier einen Gewebegradienten der Osmierung bekommen. OsO4 geht nach meinen frueheren Erfahrungen am besten / gleichmässigsten per Perfusionsfixierung.

Es ist wahrscheinlich trivial anzumerken, bzw. irgendwo hier schon geschrieben, aber vor der Perfusion mit Fixativen ist zuerst das Gefässystem mit einer möglichst isotonischen / isoosmolaren Lösung frei von Protein / Blut zu spuelen.


Mehr davon bitte !!!

Herzliche Gruesse
Holger





CaDi

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Re: HISTOLOGIE: Markscheiden Fixiert in Formalin und Glutaraldehyd
« Antwort #16 am: September 19, 2013, 18:56:30 Nachmittag »
Das Kaliumpermanganat stellt primär die Membranen in einem sehr harten Kontrast zum Zytoplasma dar (es gibt auch im Maunsbach einen kurzen Abschnitt dazu). Wie bei der Osmierung mit O4 und Kaliumhexacyanoferrat erscheint das Zytoplasma sehr licht, wodurch sich die Membranstrukturen sehr gut abgrenzen lassen.

Ribosomen werden durch das Kaliumpermanganat entweder maskiert oder nicht fixiert und ausgewaschen. Das Glykgogen wird wohl gut dargestellt, hier sind einige Seiten aus dem Maunsbach online: (S. 44)
http://books.google.de/books?id=xpoYa960wesC&pg=PA31&hl=de&source=gbs_toc_r&cad=4#v=onepage&q&f=false
Das Chromatin, bzw. die DNA, soll durch das Kaliumpermanganat gut stabilisiert werden und füllt damit eine kleine Lücke in vielen Fixierungen. Oft wird die DNA erst bei der Entwässerung durch Alkohol oder Aceton fixiert, allerdings nicht vernetzend sondern denaturierend.

In "Fixation for electron microscopy" von "Hayat" sind viele Überlegungen zur Fixierung zusammengefasst, auch wenn es für meinen Geschmack etwas zu chemisch erklärt wird ;-)

Das Osmiumtetroxid macht immer mal gerne Probleme bei uns. Es ist wohl an der Bildung von Präzipitaten beteiligt, besonders nach Fixierungen in einem Phosphatpuffer. Es sind besonders häufig membranreiche Komponenten beteiligt (z.B. Mitochondrien und Lysosomen). Evtl. ist das auch abhängig von der Dauer der Osmierung. Diese Präzipitate werden möglicherweise auch erst durch die Kontrastierung dargestellt, Mollenhauer hat 1987 2 Paper zu dem Thema publiziert.
   
Contamination of thin sections: Some observations on the cause and elimination of “embedding pepper”

Comparison of surface roughness of sections cut by diamond, sapphire, and glass knives

Wer sich traut, mit O4 zu perfundieren, wird bestimmt auch interessante und gute Ergebnisse bekommen. Das Zeug ist allerdings extrem giftig, deswegen hat man sich bestimmt auch sehr über das Glutaraldehyd gefreut :-)
Außerdem neigen Gefäße bei der Perfusion mit O4 eher zur Vasokonstriktion, deswegen hat man dem Fixativ früher häufiger Vasodilatatoren zugefügt. Das passiert beim Glutaraldehyd erst bei sehr hohen Konzentrationen in ähnlicher Weise.

Ich hoffe, meine Ausführungen sind nicht zu ausschweifend. Ich dachte mir nur, dass ich jetzt endlich mal Wissen aus meinem kleinen (manchmal praxisfernen) Spezialgebiet vorstellen kann.

Ein kleiner Tipp für Pankreas und Dünndarm bei Perfusionsfixierungen: Besonders hier sollte man auf den kolloidosmotischen Druck achten. Das Pankreas braucht nicht so viel, vielleicht 1-2% HES. Der Dünndarm braucht deutlich mehr.
(auch hier wird man im Maunsbach fündig).

Viele Grüße,
Carsten

Holger Adelmann

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Re: HISTOLOGIE: Markscheiden Fixiert in Formalin und Glutaraldehyd
« Antwort #17 am: September 19, 2013, 19:28:54 Nachmittag »
Ah - dachte mir doch, dass ich da möglicherweise bzgl KMnO4 und Ribosomen was durcheinander gebracht habe, Carsten.
Ich hatte nur in Erinnerung, dass es für bestimmte Strukturen gut geeignet ist.
Wir hatten damals mit OsO4 in Cacodylatpuffer perfundiert, und zwar nach Ga/ Fa.
Das ist aber halt beides giftig und damit für den Hobbyisten mit Vorsicht zu geniessen.

Hast Du auch Erfahrung mit Zuckerzusatz ?

Gruss, H.

CaDi

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Re: HISTOLOGIE: Markscheiden Fixiert in Formalin und Glutaraldehyd
« Antwort #18 am: September 19, 2013, 19:52:09 Nachmittag »
Mit Zuckerzusatz habe ich wenige Erfahrungen gemacht, nur in der Vorspüllösung. Er ist möglicherweise auch für das Fixativ sehr gut geeignet. HES und Dextran sind durch die z.T. sehr langen Moleküle vielleicht etwas problematisch, besonders in der Niere.

In einer Publikation wurden mal 2 oder 3 verschiedene Plasmaexpander gegenübergestellt, den Namen habe ich leider grade nicht parat. Hoffentlich erinnere ich mich da richtig... Die Wirkung wurde dabei auf den kolloidosmotischen Druck zurückgeführt, weniger auf die verschiedenen Moleküle, denn große Unterschiede in der Morphologie gab es nicht.

Es gibt unglaublich viele Publikationen und Bücher zu diesem Thema, hätte ich nie gedacht. So richtig greifbar sind die Mechanismen für mich aber noch nicht.
Von Hopwood gibt es da ein tolles review:
"Cell and tissue fixation, 1972-1982." (1985)

Viele Grüße,
Carsten

Ronald Schulte

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Re: HISTOLOGIE: Markscheiden Fixiert in Formalin und Glutaraldehyd
« Antwort #19 am: September 19, 2013, 21:31:30 Nachmittag »
@Carsten, Holger,

Tolle Erweiterungen schreibt ihr da. Ich Drucke es auch mal aus so das es nicht verloren gehen wird.

Den 'Maunsbach' wovon Carsten spricht ist ein sehr schönes Buch und kann ich jeden der was in Histologie macht und was mehr von z.B. Fixierungen wissen möchte, sehr empfehlen.
Von Saccharose Zusatz wird auch da gesprochen nur bin ich zur zeit nicht zu Hause so kann es nicht aufsuchen.
In meine Fixierung habe ich es nicht gebraucht weil ich nicht zufiel zugleich machen möchte. Ich möchte ja gerne Unterschiede lernen und sehen und Ratten haben die noch mehr wie genug.
Die Osmierte Gewebeteile habe ich selbstverständlich sehr klein gehalten und 12 Stunden Kalt (Kühlschrank) Immersion nachfixiert.
Die Teile die nicht Osmiert sondern nur FA/GA Fixiert sind kommen aber von die gleiche Niere, Leber usw.

Grusse Ronald 
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Holger Adelmann

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Re: HISTOLOGIE: Markscheiden Fixiert in Formalin und Glutaraldehyd
« Antwort #20 am: September 20, 2013, 11:30:01 Vormittag »
Gern geschehen, Ronald.

Deine Fortschritte und Ergebnisse sind mehr als Lohn für unsere Anmerkungen :)

Ich weis nicht ob Dir das folgende Buch schon empfohlen wurde, aber es enthält viele Hinweise zur Fixierung von Feingeweben für's EM,
und ist damit auch für Deine feingeweblichen Untersuchungen an Semis hochinteressant.
Es zeigt auch anhand von EM-Bildern die Effekte und Pros&Cons der verschiedenen Fixative auf Membranen, Ribosomen, DNS etc.
Ich lese gerne darin.

Herzliche Grüsse
Holger

http://www.amazon.de/Electron-Microscopy-Principles-Techniques-Biologists/dp/0763701920



« Letzte Änderung: September 20, 2013, 11:31:35 Vormittag von Holger Adelmann »

Ronald Schulte

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Re: HISTOLOGIE: Markscheiden Fixiert in Formalin und Glutaraldehyd
« Antwort #21 am: September 22, 2013, 12:08:51 Nachmittag »
@Holger,

Das Buch sieht gut aus nur denke ich das vorläufig mein 'Maunsbach' reicht. Membranen und Ribosomen geht für die LM denke ich schon was zu weit, ich werde schon so froh sein das ich mal gut Fixierte grossere Mitochondrien in z.B. die Proximalen Tubules in die Niere sehen könnte.
Wohl habe ich schon gehört das im Semibereich mein 63x NA 1.4 planapo richtig wertvoll sein wird. Das glaube ich auch gerne weil ich es jetzt schon ein Topp-Objektiv finde.

Grusse Ronald 
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Jürgen H.

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Re: HISTOLOGIE: Markscheiden Fixiert in Formalin und Glutaraldehyd
« Antwort #22 am: September 22, 2013, 14:53:35 Nachmittag »
Lieber Ronald,

Glückwunsch zu diesen überaus gelungenen Schnitten, deren Bilder ich nach Rückkehr aus meinem Urlaub genieße. Im Urlaub hatte ich mich gerade mit der Neuroglia beschäftigt: da kommen Deine Präparate genau zur rechten Zeit. Und schönen Dank auch für die liebevolle Zusammenstellung der Erläuterungen!

Schöne Grüße

Jürgen

Ronald Schulte

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Re: HISTOLOGIE: Markscheiden Fixiert in Formalin und Glutaraldehyd
« Antwort #23 am: September 22, 2013, 15:00:47 Nachmittag »
Jürgen,

Danke, es freut mich immer wenn Theorie und/oder Bilder richtig genutzt werden. Dazu ist es ja auch gedacht, auch um eine Diskussion zu starten so das 'wir' alle was lernen können.
Hoffe das ich zukünftig mit den Semidunn Technik noch mehr Details bekommen kann.

Grusse Ronald
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Holger Adelmann

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Re: HISTOLOGIE: Markscheiden Fixiert in Formalin und Glutaraldehyd
« Antwort #24 am: September 23, 2013, 10:29:30 Vormittag »
Lieber Ronald,

ja - klar kannst Du Mitochondrien in den Nierentubuli sehen, wenn Du so toll fixierst, dünn schneidest und mit deinem Leitz PL APO 63/1.4 fotografierst.

Ich möchte entsprechende Beispiele der Form halber nicht hier in Deinem schönen Thread posten, mache aber einen anderen Beitrag auf, wo Du siehst, dass dies möglich ist.
Ich bin wie immer auf Deine Ergebnisse gespannt.

Gruss
Holger