Schiefe Beleuchtung und Analyse eines komplizierten Präparates

Begonnen von Carlos, Mai 09, 2016, 10:17:55 VORMITTAG

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Oecoprotonucli

#30
Zitat von: Lupus in Mai 15, 2016, 14:11:22 NACHMITTAGS
das hat Herr Henkel angegeben: Mikrokosmos 72, 1983, S. 21-23.

Ich ergänze:

Hermann Ullrich (1983): Eine neuartige Rundum-Schrägbeleuchtung für die Durchlicht-Mikroskopie. Mikrokosmos 72, 1983, S. 21-23.

http://www.zobodat.at/publikation_volumes.php?id=42906

Gruß, S.
Ich benutze privat:
Leitz SM-Lux mit (LED-) Durchlicht und Phaco-Ausrüstung (ca. 1975-77)
Hensoldt Wetzlar Stereomikroskop DIAMAL (1950er Jahre)

carypt


Carlos

Hallo zusammen,
Mehrfach wurde in diesem Faden ,,schiefe Beleuchtung" deshalb für ,,wissenschaftliche" Untersuchungen als ,,wenig nützlich" oder sogar als ,,untauglich" eingestuft, weil sie nicht erklärbare, vom betrachteten Objekt unabhängige und nicht reproduzierbare Artefakte liefert.
Leider wurden bisher in diesem Faden von Anderen keine entsprechenden Bilder eingestellt, die dies belegen.
Obwohl ich wahrlich kein ,,Experte" –  weder für ,,schiefe Beleuchtung" noch für ,,Mikroskopie-Fotografie" -  bin, habe ich versucht, selber entsprechende Bilder zu machen.

Als Mikroskop habe ich dafür ein Leitz Ortholux mit achromatischen Leitz Objektiven und  unterschiedlichen  Leitz Kondensoren ( Berek Zweiblenden Kondensor, Phasenkontrast- Kondensor-Revolver und den ,,normalen Badewannen Leitz Kondensor", alle mit Kondensorapertur 0,9) zur Verfügung.
Fotografieren kann ich mit einer 5MP Touptek- Okularkamera und einer ,,Tandem-Optik" aus 10x Peripan GF Okular und einem 15 mm Plössl Okular.
Als Lichtquelle dient die beim Ortholux vorgesehene, entsprechend zentrierte und über einen Trafo regelbare 5A, 6V ,,Glühbirne".
Als ,,Schieflicht-Blende"  nutze ich eine ,,Kreutz-Blende" direkt auf den Lichtaustritt am Ortholux eingesetzt. Die Stellung der Blende wird über eine ,,Bertram-Linse" kontrolliert.
Als Objekt habe ich, passend zur Jahreszeit, frisch gewonnene Pilzsporen des Maipilzes (Calocybe gambosa) gewählt (Auf Objektträger gesammelt, mit Deckglas abgedeckt und Wasser als Zwischenschicht, demnächst auch mit Immersionsöl als Zwischenschicht).
Die Eigenschaften dieser Sporen nach Form, Größe und  Farbe (elliptisch-eiförmig, glatt, hyalin, 5 – 6 x 3-4 mm/1000, weiß) sollten m. E. für den Versuch geeignet sein.
Hier nun erste Bilder: 40-fach Leitz Achromat, Phasenkontrast-Kondensor in Stellung DL.  (,,Schieflicht" bei voll geöffneter Blende)
Sporen bei DL

Sporen bei ,,schiefer Beleuchtung" 1

Sporen bei ,,schiefer Beleuchtung" 2

Eigentlich müssten auf den Fotos die  im Faden angesprochenen ,,Artefakte" zu sehen sein. Ich sehe allerdings nur ein, vom Objekt unabhängigen, ,,Artefakt", ein Streifenmuster in den Aufnahmen, das allerdings auf die Verwendung von Wechselstrom für die Lichtquelle erklärbar ist.
Weitere Versuche, insbesondere mit anderen Kondensoren,  stehen noch aus. Jetzt will ich auch die noch durchführen.
Gruß Carlos

Lupus

Hallo Carlos,

ZitatMehrfach wurde in diesem Faden ,,schiefe Beleuchtung" deshalb für ,,wissenschaftliche" Untersuchungen als ,,wenig nützlich" oder sogar als ,,untauglich" eingestuft, weil sie nicht erklärbare, vom betrachteten Objekt unabhängige und nicht reproduzierbare Artefakte liefert.
das stimmt so nicht. Du hattest den Thread begonnen mit dem Thema "Steigerung der Auflösung durch schiefe Beleuchtung". Die Artefakte nehmen in dem Maße zu, in dem die Lichtquelle einen immer kleineren Teil der Kondensorapertur ausleuchtet (wie es bekanntlich auch beim Zuziehen der Aperturblende erfolgt). Daher hängt das Ausmaß der Artefakte auch bei schiefer Beleuchtung von der Form und Ausdehnung der Blende ab. Wenn ich die Auflösung signifikant erhöhen möchte muss ich die Blende für schiefe Beleuchtung ziemlich schmal halten, dadurch können die Artefakte sehr ausgeprägt werden.

Wenn ich aber die schiefe Beleuchtung moderat einsetzte sind die Artefakte auch verschmerzbar oder sogar nicht relevant - so verwendet man die schiefe Beleuchtung eigentlich zum Kontrastieren für Phasenobjekte, und das würde ich auch wissenschaftlich als legitim bezeichnen, auch andere Phasenkontrastverfahren erzeugen Artefakte. Auf den Unterschied hatte ich zweimal hingewiesen. Die wesentliche Frage ist, welchen Teil der Apertur Deine Kreutz-Blende abdeckt, meist ist deren Blendenöffnung ziemlich groß und deckt kreisbogenförmig fast nur eine Hälfte ab. Übrigens sind zumindest auf dem zweiten Bild sehr deutliche Doppelstrukturen am Rand zu sehen, das würde ich als Artefakte bezeichnen. Wenn die auch innerhalb der Objekte auftreten, könnte man sie nicht von realen Strukturen unterscheiden. Interessant wäre natürlich der gleichzeitige Vergleich mit normalem Hellfeld.

Hubert

Eckhard

Hallo Carlos,

Welches Detail der Sporen soll denn auf irgendeinem der Bilder erkennbar sein?

Herzliche Grüße
Eckhard
Zeiss Axioscope.A1 (HF, DF, DIK, Ph, Pol, Epifluoreszenz)
Nikon SE2000U (HF, DIK, Ph)
Olympus SZX 12 (HF, DF, Pol)
Zeiss Sigma (ETSE, InLens SE)

www.wunderkanone.de
www.penard.de
www.flickr.com/wunderkanone

Carlos

Hallo zusammen,
hallo Lupus,
Den ersten Teil Deines Beitrags kann ich qualitativ nachvollziehen, mir fehlt allerdings der quantitative Bezug dazu , was Du mit folgendem meinst:
ZitatDaher hängt das Ausmaß der Artefakte auch bei schiefer Beleuchtung von der Form und Ausdehnung der Blende ab. Wenn ich die Auflösung signifikant erhöhen möchte muss ich die Blende für schiefe Beleuchtung ziemlich schmal halten, dadurch können die Artefakte sehr ausgeprägt werden. Wenn ich aber die schiefe Beleuchtung moderat einsetzte sind die Artefakte auch verschmerzbar oder sogar nicht relevant - so verwendet man die schiefe Beleuchtung eigentlich zum Kontrastieren für Phasenobjekte, und das würde ich auch wissenschaftlich als legitim bezeichnen, auch andere Phasenkontrastverfahren erzeugen Artefakte.

Was muss ich also tun?
Unverständlich für mich ist Dein letzter Satz:
ZitatInteressant wäre natürlich der gleichzeitige Vergleich mit normalem Hellfeld.
Mein erstes Bild zeigt die Sporen im Durchlicht (DL). Die Einstellung wurde, wie in der ,,Mikrofibel" beschrieben, vorgenommen.
Was meinst Du nun mit ,,normalem Hellfeld"? (Die entsprechende Ausrüstung für ,,Auflicht" mit einem 40-fach Objektiv habe ich nicht.)

Hallo Eckhard,
Mit meinen Bildern wollte ich keine besondere Details der Sporen aufzeigen, vielmehr ging es mir darum, ob die Bildern 2 und 3 (schiefe Beleuchtung)  sich gegenüber dem Bild 1 im DL (Durchlicht) durch ,,unerklärbare Artefakte" unterscheiden. Deshalb wurde auch der selbe Bildausschnitt in allen Bildern gewählt.
(Trotz der schlechten Qualität der Bilder, - bessere konnte ich es im Moment nicht machen -, meine ich, dass man bei einzelnen Sporen sehr wohl mehr Details bei ,,schiefer Beleuchtung" sieht als im Durchlicht.)
Gruß Carlos

Lupus

Hallo Carlos,

ich habe zur besseren Sichtbarkeit Ausschnitte der drei Aufnahmen vergrößert nebeneinander gestellt:



Es ist schon richtig dass Bild 2 und 3 scheinbar mehr Details enthält. Aber man sieht auch dass Verdopplungen an Kanten auftreten. Woher soll man wissen was echt ist und was nicht? Und ein Effekt der veränderten Kondensorausleuchtung ist gleichzeitig ein höherer Kantenkontrast, das ist nicht gleichzusetzen mit höherer Auflösung. Dass die Auflösung etwas höher sein sollte bestreitet niemand.

In meinem letzten Satz habe ich mich zu kurz und missverständlich ausgedrückt. Ich wollte damit sagen, dass man auch ein Bild ohne schiefe Beleuchtung bräuchte mit höherer Auflösung, um die realen Details vergleichen zu können. Z.B. mit einem Objektiv höherer NA.

Hubert

carypt

die Spitze konnte der Eckhard sich nicht verkneifen . Ich würde es nicht überbewerten .

Werner

Hallo caryptus!

Eckhard ist aber im Gegensatz zu Dir ein erfahrener Mikroskopiker.

Also laß Deine überflüssigen Postings einfach sein.

Werner

Peter V.

Hallo carypt,

an Deine unverständlichen und kruden Postings haben wir uns gewöhnt, aber wenn Du jetzt meinst, über Mikroskopiker, die Dir Lichtjahre voraus sind, dämliche Kommentare ablassen zu müssen, ist hier ratzfatz Schluß für Dich. Und das schreibe ich Dir jetzt defintiniv zu letzten Mal! Verstanden?

Gruß Peter
Dieses Post wurde CO2-neutral erstellt und ist vegan. Für 100 Posts lasse ich ein Gänseblümchen in Ecuador pflanzen.

Eckhard

Hallo Carlos,

Mein Kommentar war nicht abwertend gemeint. Aber das Präparat ist ungeeignet, um Vor- und Nachteile der schiefen Beleuchtung zu zeigen.

Ich habe lange mit einem KF2 mikroskopiert und bin ein großer Freund der schiefen Beleuchtung. Man bekommt ein plastischeres Bild als mit reinem Hellfeld. Deswegen wird man auch mit der Nase auf Details gestoßen, die man im normalen Hellfeld leicht übersieht. Nur die Interpretation ist eben schwierig. Was ist Artefakt und was ist wirklich da? Das lässt sich in vielen Fällen nicht abgrenzen. Und wenn auch nur die Möglichkeit gegeben ist, die "erkannte" Struktur ist in Wirklichkeit ein Artefakt, so ist diese Methode für wissenschaftliches Arbeiten ungeeignet. Deswegen und wegen der Nicht-Reproduzierbarkeit ist die schiefe Beleuchtung durch DIK und Phasenkontrast verdrängt worden.

Hier findest Du Beispiele, die Vorteile und Grenzen aufzeigen: http://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=4344.0

Herzliche Grüße,
Eckhard
Zeiss Axioscope.A1 (HF, DF, DIK, Ph, Pol, Epifluoreszenz)
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carypt

Eckhard , bitte entschuldige , daß ich Dich einer hämischen Ausdrucksweise bezichtigt habe . War ich wohl zu empfindlich . gruß carypt

Carlos

Hallo zusammen,
hallo Lupus,
die von Dir eingestellten Bildausschnitte machen es wesentlich einfacher, die Wirkung der unterschiedlichen Beleuchtungen, einmal DL, zweimal ,,schiefe Beleuchtung" bei gleicher Blendenform, jedoch aus unterschiedlicher Richtung, zu erkennen. Danke für die Einstellung.
ZitatAber man sieht auch dass Verdopplungen an Kanten auftreten. Woher soll man wissen was echt ist und was nicht?
Ja es sieht so aus, als seien die Kanten ,,verdoppelt". Ob dies mit einer bestimmten Eigenschaft des Objekts zusammenhängt oder nicht, kann man nur mit diesen Bildern  nicht entscheiden.
Die gezeigten, frisch gewonnenen Pilzsporen waren aber, wie ich beobachtet habe, zunächst auf dem Objektträger zu kleinen Inseln durch Trocknen ,,zusammengebacken". Dabei haben sie ihre Eiform verloren und zeigten auffällige eckige Struktur. Erst durch den eingebrachten Wasserfilm zwischen Deckglas und Objektträger haben sie ihre typische Eiform wieder erhalten. Dieser Quellvorgang war zum Zeitpunkt der Aufnahme noch nicht abgeschlossen, sodass (vermutlich) die erkennbaren Unterschiede in der Oberflächenstruktur der Sporen darauf zurückzuführen sind. (Dem werde ich nachgehen.)
Die ,,Verdopplung" der Kanten ist m.E. besonders bei den Sporen des mittleren Bildausschnitts zu erkennen. Ich vermute allerdings, dass es sich dabei um eine klar abgrenzbare Hülle von Quellstoffen handelt, die eine deutlich unterschiedliche ,,optische Dichte" hat und deshalb im Schieflicht erkennbar ist. (Auch dem werde ich nachgehen.)
Hallo Eckhard,
Deinen Kommentar habe ich nicht als abwertend empfunden. Dein ,,Link" zu einem früheren Faden (vor meiner Zeit hier im Forum) war für mich sehr interessant. Ich habe ihn sehr sorgfältig gelesen und er hat mich in meinen Überlegungen zur ,,Schiefen Beleuchtung" deutlich weitergebracht. 
Mein Verdacht zu Begin des Fadens, das ,,Schiefe Beleuchtung" mehr leisten kann als allgemein angenommen, hat dadurch aber ,,neue Nahrung" bekommen.
Gruß Carlos 

treinisch

Hallo,

Zitat von: Carlos in Mai 17, 2016, 20:44:46 NACHMITTAGS
Erst durch den eingebrachten Wasserfilm zwischen Deckglas und Objektträger haben sie ihre typische Eiform wieder erhalten. Dieser Quellvorgang war zum Zeitpunkt der Aufnahme noch nicht abgeschlossen, sodass (vermutlich) die erkennbaren Unterschiede in der Oberflächenstruktur der Sporen darauf zurückzuführen sind. (Dem werde ich nachgehen.)
Die ,,Verdopplung" der Kanten ist m.E. besonders bei den Sporen des mittleren Bildausschnitts zu erkennen. Ich vermute allerdings, dass es sich dabei um eine klar abgrenzbare Hülle von Quellstoffen handelt, die eine deutlich unterschiedliche ,,optische Dichte" hat und deshalb im Schieflicht erkennbar ist. (Auch dem werde ich nachgehen.)

bitte! Das finde ich sehr spannend! Diese dubiose Artefakt-Quellschicht ist bisher das interessanteste zum Thema Artefakte, dass ich gesehen habe.

Vlg
Timm
Gerne per Du!

Meine Vorstellung.

Carlos

Hallo Timm,
ZitatDiese dubiose Artefakt-Quellschicht ist bisher das interessanteste zum Thema Artefakte, dass ich gesehen habe.
Das ist doch m. E. nicht neu. Voll transparente Quellschichten kann man mW. in strengem DL nicht sehen. Dazu braucht man ,,schiefe Beleuchtung", "Phasenkontrast" oder "DIK". Derartige ,,Hüllschichten" kennt man  bei vielen Mikroorganismen und kann sie darstellen.  Als Beispiel seien z.B. die im Forum oft als Bild gezeigte ,,Blutregenalge" genannt.
Ich halte es für sehr wahrscheinlich, das auch Pilzsporen eine derartige Hülle haben können. Die ,,Pilzner" hier im Forum  können dazu sicher Kompetenteres sagen.
Eines scheint mir bei der Interpretation von ,,Schieflicht-Bildern" allerdings sehr wichtig: Man darf nie vergessen, das der 3D Eindruck des Bildes, so schön wir ihn auch finden, eine ,,Täuschung durch die Bildverarbeitung im Gehirn" ist. Das wird bei der Interpretation von ,,Schieflichtbildern" ( und DIK-Bildern) m.E. oft vergessen.
(Wer einmal unter einem auf einer flachen Decke aufgemalten Gemälde gestanden hat, das ein räumliches Kuppelgewölbe darstellen soll, ,,schwört", das da eine Kuppel vorhanden ist.) 
Gruß Carlos