Botanik: Testfärbung mit Brilliantkresylblau an Pflanzenschnitten

[Bernhard Kaiser]

Hallo liebe Regi,

wenn ich mich recht erinnere gingen diese ganzen Färbestudien und die damit verbundenen Erkenntnisse, von Deiner Einfärbung von Sphagnum palustre mit Brilliantkresylblau (BKB) aus, weil Du kein Methylenblau hattest.

Gratulation!

Freundliche Grüße
Bernhard Kaiser

[Fahrenheit]

Lieber Klaus,

vielen Dank für Deine lobenden Worte! Selbstverständlich ist das von mir zu unrecht verdächtigte BKM nun vollständig rehabilitiert. 

Mal sehen, was noch so in der Färbung steckt, vielleicht können sich die zwei Farbstoffe ja noch mit einem Dritten im Bunde anfreunden.

Lieber Bernhard,

die Anrede in Deinem Beitrag lässt mich etwas verwundert zurück. Gab es hier eine Antwort von Regi, die wieder verschwunden ist?

Herzliche Grüße
Jörg

[Bernhard Kaiser]

Lieber Jörg,

bitte um Entschuldigung.
Ich habe da etwas durcheinander gebracht. Klaus Herrmann hatte als erster Brilliantkresylblau zum Färben von Torfmoos angewandt. 

Ich bin die ganzen Punkte in den Threads nochmal durchgegangen - was durch die Löschungen des unsäglichen*** erschwert wurde - und stellte fest, daß Regi mit FCA gefärbt hatte.

Dank an Herrn Herrmann, der damit die ganzen Studien angestoßen hat.

Schönes Wochenende und freundliche Grüße
Bernhard Kaiser

[Klaus Herrmann]

Das lieber Herr Kaiser habe ich auch gemacht, weil ich mir selber nicht mehr sicher war:

Ich bin die ganzen Punkte in den Threads nochmal durchgegangen

-

und da ist mir zum ersten Mal aufgefallen:

was durch die Löschungen des unsäglichen*** erschwert wurde

..dass wir hier einen unsinnigen schweizer Käse durch diese Aktion haben. Eigenartiges Verhalten, um es mal vornehm auszudrücken.

Die Rehabilitation des genialen BKB  könnten wir doch zum Anlass nehmen zum "Du" überzugehen. Ich biete das ja neuerdings auch in meiner Signatur öffentlich an!

[Bernhard Kaiser]

Hallo Klaus,

aber gerne per Du.

Freundliche Grüße
Bernhard K.

[Fahrenheit]

Hallo liebe Färberzunft,

wie schon angedeutet, habe ich heute mit Acriflavin als dritter Farbe experimentiert und möchte die Ergebnisse gerne vorstellen.

Anbei wie immer das Rezept, an der Technik hat sich nichts geändert.

- Erweiterung der Färbung um eine Stufe mit Acriflavin (Lavendel Stängel quer in 70% Ethanol)
  - BKB 0,125%
  - Acriflavin 2% für 30 Sekunden
  - Eosin/Nelkenöl für 20 min
  - Xylol/Kanadabalsam statt Isopropanol/Euparal

- Wässern (2-mal wechseln)
- Färben in BKB 0,125% für 5 Minuten
- Wässern (2-mal wechseln)
- Färben mit Acriflavin für 30 Sekunden
- Wässern (wechseln bis kein Acriflavin mehr im Spülwasser) 
  (Lupenkontrolle: Sklerenchym grün, restliches Gewebe gelb-orange)
- Entwässern in Isopropanol (4-mal wechseln, insgesamt 10 Minuten, einige Schnitte zu
  Vergleichszwecken zurückgehalten)
- Färbung in Eosin/Nelkenöl für 20 Minuten (Ansatz wegen eines Unfalls mit sehr viel Eosin) 
  (Beobachtung: Eosin verklumpt beim Kontakt mit Nelkenöl - Beize. Eventuell sollte mit Eosin
  in wässriger oder alkoholischer Lösung gefärbt werden, um anschließend in Nelkenöl zu beizen.)
- Überführen der Schnitte in Xylol, vorsichtig mit dem Pinsel bewegen, um
  das Eosin/Nelkenöl zu entfernen (10 Sekunden)
- Abziehen und Xylol nachgeben, Zugabe der Vergleichsschnitte
  (3-mal wechseln, insgesamt 15 Minuten)
- Einschließen in Kanadabalsam

Hier nun die Präparate im Vergleich - alle Stängelquerschnitte vom Lavendel, ca. 25 µm. Zunächst die Bilder 24 bis 27 in folgender Reihenfolge:
- BEN (Wiederholung von Bild 23)
- AcriB Vorfärbung BKB und Acriflawin
- AcriBEN die komplette Färbung
- Wacker zum Vergleich
Alle Bilder bei 100-facher Vergrößerung, Bild 25 und 26 Einzelaufnahmen, die beiden anderen Bilder sind gestackt.






Wie ich finde, hat auch die Vorfärbung mit Brylliantkresylblau und Acriflavin ihren ganz eigenen Reiz. Viel differenzierter ist jedoch die komplette Färbung mit Eosin in Nelkenöl in der letzten Stufe.
Hier kommen zum Beispiel die Strahlen im Xylem deutlicher heraus und die Tüpfelkanäle im Sklerenchym sind überhaupt erst zu sehen.
Hier kann sich die neue Färbung zumindest mit meiner Wackerfärbung des gleichen Materials durchaus vergleichen.

Hier noch zwei Detailaufnahmen des Sklerenchyms: 

Bild 28: Sklerenchym in einer Ecke des Lavendelstängels mit AcriB, die Tüpfel sind auch bei 400-facher Vergrößerung nicht zu erkennen, Stapel aus 3 Bildern


Bild 29: Der gleiche Ausschnitt in einem komplett gefärbten Präparat (AcriBEN), Vergrößerung wieder 400x, Stapel aus 8 Bildern. Hier treten die Tüpfelkanäle sehr deutlich hervor.


Etwas problematisch finde ich die Schärfe besonders der beiden letzten Aufnahmen. Mehr war auch nach akribischem Einstellen des Mikroskops nicht zu machen und auch im Okular blieb eine gewisse Unschärfe erhalten. Ist dies vielleicht ein Effekt, der durch das noch flüssige Kanadabalsam zustande kommt? Ich bin etwas ratlos, die Optik ist jedenfalls OK, bei anderen Präparaten tritt das Problem nicht auf.

Anregungen und Kritik sind wie immer willkommen.

@Bernhard, vielen Dank für Deine Aufklärung!

Herzliche Grüße
Jörg

[Druse]

Hallo Jörg,

vielen Dank für diese sehr gut dokumentierte Versuchsreihe! Hoffentlich bleiben die Farben erhalten.

Dass die Tüpfelkanäle so toll herauskommen, begeistert mich besonders 

[Fahrenheit]

Liebe Mila,

wenn man genau hinschaut, kann man in Bild 28 und 29 erkennen, dass die Sklerenchymzellen ganz am Rand des Stützgewebes einen Gradienten vom hellgrün (ganz Außen) nach dunkelgrün aufweisen.

Wasser sollte nach dem Öl- und dem mehrmals gewechselten Xylolbad keine Rolle mehr spielen. Langsamhabe ich das Acriflavin in Verdacht ... hier eventuell im Zusammenspiel mit dem sauren Kanadabalsam.

Mal schauen, wie sich die Färbungen entwickeln.

Herzliche Grüße
Jörg

[Detlef Kramer]

Lieber Jörg,

die Ergebnisse Deiner Tests sind schon wirklich beeindruckend. Klar, so deutlich habe auch ich die Tüpfelkanäle noch nicht gesehen, wie in Deinem letzten Foto. Aber, ich muss doch etwas zur Nachdenklichkeit anregen. In dem vorletzten Foto (ohne Eosin) sieht man die Tüpfelkanäle sehr wohl und zwar sehr fein, nämlich so, wie sie halt sind. In dem Eosin-Präparat sind sie dagegen fett und als Doppel-Struktur zu erkennen. Das gilt auch für andere Strukturen. Mir scheint, dass das Eosin sich irgendwie und etwas flockig an die anderen Farbstoffe anlagert oder undefiniert in die Zellwände eindringt. Das mag auch zu dem Eindruck leichter Unschärfe zu führen, was das Foto ja nicht ist.

Aber: der Zweck heiligt bekanntlich die Mittel. Um die Tüpfel so richtig deutlich sichtbar zu machen, ist das eine gute Möglichkeit.

Herzliche Grüße
Detlef

[Druse]

Hallo und Guten Abend,

ja, bei Bild 28 sieht man die Zartheit der Tüpfelkanäle und bei Bild 29 dann eindrucksvoll, wie viele es sind. Beide Fotos sind (für mich pädagogisch) wertvoll, wenn man sie hintereinander zeigt und man könnte fast sagen, erst wie "ungeschminkt" und dann ein bisschen "dick aufgetragen".
Ich hoffe Jörg, Du verzeihst mir den Vergleich, meine Schüler würden so sofort wissen, was ich meine... 

Einen schönen Abend und

[Fahrenheit]

Guten Abend Mila, guten Abend Detlef,

zunächst vielen Dank für den Zuspruch!

Ich habe mich etwas ungeschickt ausgedrückt. In der AcriB-Färbung sind die Tüpfelkanäle nicht an gefärbt, einige von ihnen, die nahe der gewählten Schärfenebene liegen, kann man als leichte Aufhellungen erkennen, wenn man weiß, dass da welche sein müssen. Aber sie heben sich nicht durch eine Kontrastfarbe ab.

Mit dem Eosin in der AcriBEN Färbung ist das anders. Hier sind , denke ich, die Lumen der Kanäle wohl aufgrund des Kapillareffektes noch mit Eosin gefüllt oder das Eosin/Nelkenöl hat noch vorhandene Reste des Zellplasmas rot gefärbt.
Schließlich sind auch die 'Innenwände' der sklerifizierten Zellen rot.
Somit treten die Tüpfelkanäle sehr deutlich hervor, was auch für die Interzellularen gilt.

Mal sehen, ob die  Präparate schärfere Aufnahmen erlauben, wenn das Kanadabalsam durchgehärtet ist.

Mila, Deine Erklärung ist nachvollziehbar und sofort einsichtig 
Wenn Du die Bilder in voller Auflösung haben möchtest, sag' Bescheid - oder warte noch ein paar Tage: wie gesagt, da sollte noch bessere Aufnahmen möglich sein.

Herzliche Grüße
Jörg

[Fahrenheit]

Guten Abend liebe Färberzunft,

hier nun ein neuer Satz Präparate (und Bilder davon), in denen ich das Acriflavin als dritte Farbe durch Chrysoidin ersetzt habe. ChrysoBEN quasi 

Wie schon bei den vorherigen Vorstellungen zunächst das Rezept (Technik unverändert und das Ausgangsmaterial ist weiterhin der Blütenstängel des Lavendels in 25 µm Schnitten von Rolf-Dieter Müller):

- Testfärbung mit Chrysoidin statt Acriflavin (Lavendel Stängel quer in 70% Ethanol)
  - BKB 0,125%
  - Chrysoidin 0,1% für 3 min
  - Eosin/Nelkenöl für 20 min

- Wässern (2-mal wechseln)
- Färben in BKB 0,125% für 5 Minuten
- Wässern (2-mal wechseln)
- Färben mit Chrysoidin für 3 Minuten
- Wässern (wechseln bis kein Chrysoidin mehr im Spülwasser) 
  (Lupenkontrolle: Sklerenchym grün, restliches Gewebe blass gelb, Cuticula orange)
- Entwässern in Isopropanol (4-mal wechseln, insgesamt 10 Minuten, 2 Schnitte zu
  Vergleichszwecken zurückgehalten)
- Färbung in Eosin/Nelkenöl für 20 Minuten (Ansatz wie oben)
- Überführen der Schnitte in Xylol, vorsichtig mit dem Pinsel bewegen, um
  das Eosin/Nelkenöl zu entfernen (10 Sekunden)
- Abziehen und Xylol nachgeben, Zugabe der Vergleichsschnitte
  (3-mal wechseln, insgesamt 15 Minuten)
- Einschließen in Kanadabalsam

Bild 30: Lavendelstängel quer, Vorfärbung BKB und Chrysoidin, Vergrößerung 100x, Stapel aus 7 Bildern


Bild 31: Lavendelstängel quer, komplette Färbung "ChrysoBEN", Vergrößerung 100x, Stapel aus 8 Bildern


Im Vergleich zur AcriBEN Färbung (Bilder 24 und 25) kommen alle Farben viel verhaltener heraus. Auffällig ist, dass die Farbkombination sowohl in der Vorfärbung als auch in der Komplettfärbung klar zwischen Parenchym (blassgelb bzw. pink) und Endodermis / Hypodermis (dunkelblau) unterscheidet.
Die Cuticula wird schön orange an gefärbt.

Nun noch eine Ausschnittsvergrößerung, wieder in beiden Varianten.

Bild 32: Lavendelstängel quer, Vorfärbung BKB und Chrysoidin, Vergrößerung 200x, Stapel aus 8 Bildern


Bild 33: Lavendelstängel quer, komplette Färbung "ChrysoBEN", Vergrößerung 200x, Stapel aus 6 Bildern 


Hier kann man schön erkennen, dass das Phloem zunächst dunkelblau gefärbt ist, dieses aber dann vom Eosin verdrängt wird, womit das Phloem pink erscheint.
Sklerenchym und Xylem sind olivgrün bzw. dunkelgrün an gefärbt, die Tüpfelkanäle sind auch hier erkennbar, werden aber nicht so stark hervorgehoben, wie in der Kombination "AcriBEN".
In den Palisadenzellen bleiben die Chloroplasten dank der dezenteren Färbung deutlich erkennbar - dies ein Vorteil zur Kombination mit Acriflavin.

Herzliche Grüße
Jörg

[Fahrenheit]

Hallo liebe Färberzunft,

da Klaus Herrmann mich freundlicherweise mit etwas Erythrosin (Dinatriumtetraiodfluoresceinat. E127) versorgt hat, kann ich heute noch einmal nachlegen.

In der folgenden Färbung habe ich das Eosin durch das Erythrosin ersetzt. Dies macht die Stufe mit dem Nelkenöl überflüssig, da mit Erythrosin in wässriger Lösung gefärbt werden kann. Nach der Färbung kann also mit Isopropanol entwässert und in Euparal eingeschlossen werden - schwubs ist auch das Xylol aus dem Rezept verschwunden.

Erythrosin ist übrigens ein Lebensmittelfarbstoff (E127), der zum Beispiel zum Färben von Cocktailkirschen, Fruchtstückchen in den gesunden Früchtemüslis und diversen Medikamenten genutzt wird. Er ist in letzter Zeit etwas in Verruf geraten - also das Müsli lieber selber frisch ansetzen. 

Wie gewohnt zunächst das Rezept (Technik unverändert und das Ausgangsmaterial ist weiterhin der Blütenstängel des Lavendels in 25 µm Schnitten von Rolf-Dieter Müller):

- AcriBER Färbung mit BKB, Acriflavin und Erythrosin (Dinatriumtetraiodfluoresceinat, E127) in wässrigen Lösungen
  (Lavendelstängel quer in 70% Ethanol)
  - BKB 0,125%
  - Acriflavin 2% für 30 Sekunden
  - Erythrosin für 10 Minuten
  - Isopropanol/Euparal und Xylol/Kanadabalsam

- Wässern (2-mal wechseln)
- Färben in BKB 0,125% für 5 Minuten
- Wässern (2-mal wechseln)
- Färben mit Acriflavin für 30 Sekunden
- Wässern (wechseln bis kein Acriflavin mehr im Spülwasser) 
  (Lupenkontrolle: Sklerenchym grün, restliches Gewebe gelb-orange)
- Färben mit Erythrosin in wässriger Lösung (Ansatz einige Kristalle in 10 Tropfen Aqua dest.)
- Wässern (Wechseln bis kein Erythrosin mehr im Spülwasser)
- Entwässern mit Isopropanol (2-mal wechseln nach 10 und 30 Sekunden)
- 2 Schnitte weiter Entwässern in Isopropanol (2-mal Wechseln für jeweils 5 Minuten)
- Einschließen in Euparal

Bild 34:Lavendelstängel quer, Färbung "AcriBER", Vergrößerung 100x, Stapel aus 10 Bildern


Bild 35:Lavendelstängel quer, Färbung "AcriBER", Vergrößerung 200x, Stapel aus 7 Bildern


Die AcriBER - Kombination besticht durch kräftige Farben. So erscheint das Palisadenparenchym in einem satten Rotton, während die Epidermis und die Hypodermis orange eingefärbt sind.
Das Stützsklerenchym und das Xylem hier wieder in grün, die Tüpfelkanäle sind erkennbar, aber nicht besonders hervorgehoben.

Somit lassen sich auf der Basis von Brillantkresylblau (BKB) mit den Farbstoffen Acriflavin, Chrysoidin, Eosin und Erythrosin einige interessante Färbungen für botanische Schnitte erstellen, denen alle gemeinsam ist, die übliche Farbverteilung zwischen 'lebendem' und 'verholztem' Gewebe quasi auf den Kopf zu stellen.

Bei der Vielzahl verfügbarer Farbstoffe ist hier sicherlich noch Luft für Experimente. Interessant wäre auch, das im bisherigen Rezept eher 'ereignislose' Chrysoidin in einer Nachfärbung in Alkohol oder Xylol (?) einzusetzen.

Herzliche Grüße
Jörg