Vitalfärbung von Strudelwürmern mit Neutralrot

Begonnen von Michael, Februar 25, 2018, 12:13:53 NACHMITTAGS

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Michael


Hallo in die Runde,

die Strudelwürmer Stenostomum leucops (Bild 1) und Stenostomum unicolor (Bild 2) findet man weltweit sehr häufig in Tümpelproben. Dennoch sind Fotos dieser interessanten Tiere recht selten. Der Grund dafür dürfte sein, dass diese weichen und empfindlichen Strudelwürmer für den Mikroskopiker sehr schwierige Objekte bei der Lebendbeobachtung darstellen. Legt man die Würmer mit dem Deckglas fest, so wird die Form der Tiere - lange vor der Unbeweglichkeit - sehr stark verändert. Erhöht man den Deckglasdruck zu stark, sterben die Strudelwürmer ab und zerfallen nahezu sofort in die Einzelzellen. Auf der anderen Seite erlaubt die Beobachtung der fast kontrastlosen und ruhelosen Tiere während der freien Bewegung meist keine guten Fotos. In der älteren Literatur wird deshalb eine Lebendfärbung von Strudelwürmern mit Neutralrot empfohlen, die ich deshalb ebenfalls ausprobieren wollte.


Bild 1: St. leucops, Übersicht; A: dorsal, B: lateral;
D: Darm, Dd: Darmdrüsen; hG: hintere Gehirnlappen; vG: vordere Gehirnlappen; P: Pharynx; pD: Pharynx-Drüsen; Wg: Wimperngrube



Bild 2: St. unicolor; Tierkette aus zwei Einzeltieren

Die Färbung erfolgte - wie in https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=30430.0 beschrieben - in einem Mikroaquarium, so dass eine Langzeitbeobachtung der Tiere möglich war. Nach ca. einem Tag waren bei den Tieren die Haut vollständig gefärbt, wodurch eine Beobachtung der inneren Organe unmöglich wurde.


Bild 3: St. leucpos, 1 Tag nach Färbebeginn; Übersicht

Sowohl St. unicolor als auch St. leucops tragen in ihren Hautzellen stäbchenförmige Schleimkapseln (Rhabditen), die bei Gefahr oder zum Wundverschluss abgefeuert werden können und deren Schleimfäden dann im Wasser aushärten. Diese Rhabditen werden durch Neutralrot stark gefärbt, so dass deren Verteilung sehr deutlich wird. Dabei zeigen sich bei den beiden untersuchten Arten deutliche Unterschiede.


Bild 4: St. leucpos, 3 Tag nach Färbebeginn; Verteilung der Rhabditen; oben ventral, unten dorsal

Bei St. leucops ist die Verteilung der Rhabditen auf der dorsalen und ventralen Seite deutlich unterschiedlich. Auf der Rückenseite zeigt sich eine deutliche Felderung (in der Literatur "Punktfelder" genannt), die den Epidermiszellen entspricht und unterschiedlich ausgerichtete Rhabditenreihen zeigen. Auf der Bauchseite dagegen sind die Rhabditen in Längsreihen angeordnet und markieren so die Gleitsohle des Tieres.
St. unicolor zeigt dagegen keine ausgeprägte Gleitsohle, sondern bewegt sich unabhängig von seiner Orientierung gleich geschickt. Dies spiegelt sich in der gleichmäßigen und sehr dichten Verteilung der Rhabditen wieder.


Bild 5: St. unicolor, 3 Tag nach Färbebeginn; Übersicht

Da diese Schleimkapseln bei dieser Art sehr eng und zahlreich sind, erscheint das Tier praktisch vollständig gefärbt. Um diese Überfärbung zu korrigieren, habe ich versucht, die Färbung der Tiere in reinem Wasser zu differenzieren. Dazu wurden die Tiere in Frischwasser überführt. Leider wurde dabei der St. leucops verletzt, so dass sich die folgende Darstellung auf St. unicolor beschränken muss.
Nachdem Neutralrot in eine Zelle eingedrungen ist und sich in seine "rote Form" umgewandelt hat, kann es die Zellwände nicht mehr durchdringen. Deshalb bleiben einmal gefärbte Zellen auch nach Umsetzen des Tieres in reines Wasser weiterhin gefärbt. Die Farbe kann deshalb nur abgebaut werden, wenn die entsprechend gefärbten Zellen absterben und durch neue Zellen ersetzt werden. Dieser Zellerneuerungsprozess ist in der - wohl stark beanspruchten - Epidermis der Tiere relativ häufig und kann aufgrund der Färbung gut beobachtet werden. Einzelne Zellen werden aus dem Zellverbund heraus gelöst und sinken in das unter der Haut liegende Gewebe ab. Hier runden sie sich ab und sind als dunkelrote, frei beweglich Gebilde sichtbar. Diese Zellen werden dann im Laufe der Zeit durch Fresszellen abgebaut und verschwinden.


Bild 6: St. unicolor, ca. 3 Wochen nach Färbebeginn; Abbau der gefärbten Hautzellen

In Bild 6 erkennt man z.B. etwa in der Mitte der Tieres am Rand eine nahezu ungefärbte, neue Hautzelle, die die runde, rote und bereits abgesunkene Zelle daneben ersetzt. Durch diesen kontinuierlichen "Differenzierungsprozess" nimmt die Färbung der Haut kontinuierlich ab und das schwächer gefärbte Gewebe der inneren Organ wird nun sichtbar.


Bild 7: St. unicolor, ca. 3 Wochen nach Färbebeginn; Epidermis während der "Differenzierung"

Während dieser lange anhaltenden "Entfärbung" fiel mir auf, dass sich etwa in der Mitte des Tieres eine Einschnürung des Darmes entwickelte. Über die nächsten ca. zwei Wochen konnte ich hier die Entwicklung eines neuen Tieres beobachten. Neben der sehr seltenen geschlechtlichen Fortpflanzung tritt bei St. unicolor meist vegetative Fortpflanzung auf: Der hinter Teil eines Tieres entwickelt sich zu einem neuen Tier und wird dann abgeschnürt (Paratomie).


Bild 8: St. unicolor, ca. 4 Wochen nach Färbebeginn; Beginn der vegetative Fortpflanzung
oben: Beginnende Einschnürung bei Pfeil; links unten: Hohlraum im Gewebe; recht unten: Porus des Pharynx


Einen Tag nach Beginn der Einschnürung bildete sich ein kugelförmiger Hohlraum im Gewebe hinter der Einschnürung. Aus diesem Hohlraum entwickelt sich im Weiteren der Saugmagen (Pharynx) des Tochterzooides. Nach einem weiteren Tage bildet sich in der Haut des Tiers ein Porus, der den zukünftigen Ausgang des Pharynx bildet.


Bild 9: St. unicolor, ca. 4 Wochen nach Färbebeginn; Übersicht

Da neu gebildete Zellen nur schwach durch die Reste des Neutralrots gefärbt werden, kann man gut zwischen bestehendem und neu gebildetem Gewebe unterscheiden. Um die Einschnürung herum wurde ein Ring neuer Zellen gebildet, aus denen sich im Weiteren das Gehirn des Tochterzooides entwickeln wird. Auch das Gewebe des neuen Pharynx mit den entsprechenden Pharynxdrüsen wurde neu gebildet. Der Mund des Tieres hat sich inzwischen deutlich geweitet.


Bild 10: St. unicolor, ca. 5 Wochen nach Färbebeginn; Seitenansicht

In der Seitenansicht erkennt man, dass der neue Saugmagen keine Verbindung zum Darm besitzt. Der Darm läuft von dem Mutterzooid zwischen dem Gehirn und dem Pharynx in den Darm des Tochterzooids. Der Tochterzooid wird also weiterhin von der Mutter ernährt. Für den Pharynx bildet sich bereits ein Ausstülpung an der Bauchseite des Tochterzooids. Die Verbindung zur Mutter ist der künftige Kopflappen des Tochtertieres.


Bild 11: St. unicolor, ca. 6 Wochen nach Färbebeginn

Innerhalb einiger Tage schnürt sich der Tochterzooid immer weiter von der Mutter ab. Die Versorgung der Tochter erfolgt über einen immer enger werdenden Darmkanal von der Mutter aus. Wimperngruben, Gehirn und lichtbrechende Körper sind immer besser zu erkennen. Der Pharynx des Tochterzooids hat weiterhin keine Verbindung zum Darm und trägt nicht zur Nahrungsaufnahme bei.


Bild 12: St. unicolor, ca. 6 Wochen nach Färbebeginn; Übersicht

Schließlich ist der Tochterzooid voll entwickelt und ist nur noch über eine dünne Verbindung am Darm der Mutter angeschlossen. Immer noch ist das Tochtertier nicht in der Lage, sich selbst zu ernähren. Die Trennung steht kurz bevor.


Bild 13: St. unicolor, ca. 6 Wochen nach Färbebeginn; nach Trennung

Am nächsten Tag fand ich dann die Tiere getrennt vor. Beide Tiere waren in eine Ruhephase eingetreten, in der sie sich nur recht unwillig und langsam bewegten. In beiden waren wieder abgestoßene Zellen als rote Flecken zu sehen, die die nächsten Tage vollständig abgebaut wurden. Offensichtlich war nach der Trennung ein Umbau auf Zellebene nötig.


Bild 14: St. unicolor, ca. 6 Wochen nach Färbebeginn; Tochtertier

So wurde im Tochtertier beispielsweise die Darmverbindung zum Muttertier resorbiert und der Pharynx an den eigenen Darm angeschlossen. Erst jetzt war das Tochtertier selbstständig lebensfähig.

Zum Schluss noch einige Impressionen dieser für mich gar nicht langweiligen kleinen Würmern:


Bild 15: St. unicolor, ca. 7 Wochen nach Färbebeginn; Rhabditen


Bild 16: St. unicolor, ca. 7 Wochen nach Färbebeginn; Gehirn


Bild 17: St. unicolor, ca. 7 Wochen nach Färbebeginn; Mundöffnung


Bild 18: St. unicolor, ca. 7 Wochen nach Färbebeginn; Fang eines Ciliaten


Die Kombination Neutralrot und Mikroaquarium erwies sich in meine Augen als ideal:
- Die Färbung konnte problemlos unter Beobachtung mit dem Mikroskop durchgeführt werden
- Anfänglich wurden die Rhabditen sehr kontrastreich gefärbt und konnten deshalb gut untersucht werden
- Nach Umsetzen in Frischwasser kann über einen längeren Zeitraum die Zellerneuerung live beobachtet werden, da die abgebauten Zellen gefärbt bleiben während neu gebildete Zellen nur schwach gefärbt sind.
- Die vegetative Fortpflanzung konnte verfolgt werden. Dabei war es möglich, neu gebildeten Zellen (schwach gefärbt) von bereits bestehenden Zellen zu unterscheiden.
- Nach einer mehrwöchigen Differenzierungsphase erlaubt die Färbung, die inneren Organe sehr deutlich abzugrenzen. Die Beobachtungsbedingungen sind jetzt ideal.

Abschließend möchte ich mich noch für Länge des Beitrags entschuldigen - aber nach einer faszinierenden Beobachtungszeit von ca. 7 Wochen und einigen hundert Fotos konnte ich mich einfach nicht bremsen.

Viele Grüße

Michael

Gerne per Du

Jürgen Boschert

Hallo Michael,

da kannst Du Dich tausendmal entschuldigen, ich bedanke mich trotzdem bei Dir für diesen tollen Beitrag. Gerne mehr !

Gruß !

JB
Beste Grüße !

JB

Bernhard Lebeda

Hallo Michael

kann mich nur anschließen: hoch interessant. Besonders die Teilung finde ich faszinierend: was die Evolution nicht alles an präzisen Abläufen hervorgebracht hat-kaum zu glauben, wenn man es nicht selbst sähe!!

viele Mikrogrüße

Bernhard
Ich bevorzuge das "DU"

Vorstellung

Jürgen H.

Lieber Michael,

wie gut dass Du Dich nicht bremsen konntest;-) Vor allem bin ich beeindruckt, wie gut man durch die Färbung zwischen altem und neu gebildeten Zellen unterscheiden kann (und natürlich von Deiner Geduld und Beobachtungsgabe)

Hast Du einmal andere Vitalfärbungen probiert, z.B. Methylenblau?

Schöne Grüße

Jürgen

Gerald

Hallo Michael,

vielen Dank für den tollen Bericht. Hat Spass gemacht zu lesen.

Viele Grüße

Gerald

Michael

#5
Hallo,

vielen Dank für die netten und ermutigenden Rückmeldungen.

@Jürgen:
Bei anderen Objekten habe ich Janusgrün und Metylenblau ausprobiert, bin aber zu keinen guten Ergebnissen gelangt. Beide Farbstoffe scheinen mir toxischer als Neutralrot zu sein - hier muss man wohl genauer auf die Konzentration achten, als ich bei meinen Freihandversuchen gewohnt bin. Außerdem scheinen beide Farbstoffe den Zutritt von Luftsauerstoff bei der Vitalfärbung zu benötigen, so dass eine Färbung unter dem Deckglas nur schwer möglich ist.
Für Strudelwürmern wurden hier eine ganze Reihe von Farbstoffen ausprobiert:

Seeds Carter, Jennette.  Reactions of Stenostomum to vital staining. Journal of Experimental Zoology. 65. 159 - 181. (Download: http://booksc.org/book/1497634/ea45e4)

@Bernhard:
Als Amateur habe ich mir ein gewisses "kindliches Staunen" bewahrt, aus dem ich nicht mehr herauskomme, seit ich mir mit den Mikroaquarien auch die zeitliche Dimension erobert habe. Es ist wirklich faszinierend, wie perfekt bereits kleinste Organismen an ihren Lebensraum angepasst sind.

@Gerald:
Speziellen Dank auch für Deinen "Daumen hoch". Mir ist es durchaus wichtig, eine einfache Rückmeldung zu bekommen, dass sich die Mühe des Beitrags auch für andere gelohnt hat - unabhängig von "wissenschaftlich fundierten Anmerkungen".

Viele Grüße

Michael


Gerne per Du

RainerTeubner

Hallo Michael,

ich bin sehr beeindruckt von Deinen Arbeiten und den perfekten Bildern dazu!

Viele Grüße

Rainer
Mikroskop: Carl Zeiss Standard Universal
Bildbearbeitung: Gimp, Helicon focus und picolay
Kamera: Canon EOS 5D II

Jürgen H.

Bei anderen Objekten habe ich Janusgrün und Metylenblau ausprobiert, bin aber zu keinen guten Ergebnissen gelangt. Beide Farbstoffe scheinen mir toxischer als Neutralrot zu sein


Das scheint wohl so zu sein. Hier gibt es eine Untersuchung zur Toxizität bei Paramecium

http://microscopy-uk.org.uk/mag/indexmag.html?http://microscopy-uk.org.uk/mag/artfeb00/rhvital.html

Die dort gewählten Konzentrationen sind beachtlich gering.

Ist es nicht möglch, Deine Strudelwürmer zunächst in einer Petrischale vital zu färben und dann auf den OT zu bringen?

Schöne Grüße

Jürgen

Michael

Hallo,

@ Rainer:
Vielen Dank für Dein Lob - aber von perfekten Bildern bin ich meilenweit weg!  :'(

@Jürgen:
Danke für den Link. Vitalfärbungen sind ein interessantes Thema, da zusätzlich zur statischen Anatomie auch die laufenden biologischen Prozesse mit abgebildet werden. Eine Vitalfärbung mit Methylenblau steht seit langem oben auf meiner ToDo-Liste, da hier Nervenzellen selektiv gefärbt werden sollen. Vielleicht wären Strudelwürmer da ein gutes Objekt (eigentlich wollte ich auf eine Hydra warten, für die die Färbung in der Literatur beschrieben ist) - mal sehen ob ich noch welche finde. Die Färbung müsste dann in einem offenen Gefäß stattfinden, wobei ich mir noch nicht im klaren bin, wie ich den Verlauf der Färbung kontrollieren kann. Direkt unter Mikroskop-Kontrolle ist das leichter.

Viele Grüße

Michael

Gerne per Du

Michael

Hallo,

ich wollte nur der Vollständigkeit halber berichten, dass ich - ohne Erfolg - versucht habe, St. leucops und St. unicolor mit Methylenblau zu färben.
Selbst bei kleinsten Konzentrationen verstarben die Strudelwürmer innerhalb kurzer Zeit (maximal ca. 30 min), obwohl andere Organismen wie Ciliaten und Flagellaten keinerlei Reaktion (und wegen der geringen Farbstoffkonzentration keine  Färbung) zeigten. Wenn ich nicht irgend etwas gehörig falsch gemacht habe, glaube ich deshalb nicht, dass diese Arten mit Methylenblau vital gefärbt werden können.

Viele Grüße

Michael
Gerne per Du

Jürgen H.

Lieber  Michael,

vielen Dank für Deine Nachricht!

Schöne Grüße

Jürgen

treinisch

Hallo,

@Michael,

super Beitrag, danke!
Ich habe auch mal mit Lebendfärbung experimentiert. Du warst viel erfolgreicher als ich.

@Thilo
Zitat von: paramecium in März 05, 2018, 22:52:51 NACHMITTAGS
Noch kurioser finde ich, dass der Einsatz von Methylenblau als Medikament statthaft ist, während bestimmte Fluorchrome, wie Ethidiumbromid, aus den Labors verbannt werden wollen.

kannst Du diesen offensichtlich verschlüsselten Satz für mich dekodieren? Darf ich Dich zu einem kleinen lebend-Versuch einladen? Also ich wäre evtl. bereit 1g Methylenblau schlucken, nimmst Du das Ethidiumbromid? Ist ja viel weniger gefährlich, wie du sagst?

vlg

Timm
Gerne per Du!

Meine Vorstellung.

Michael

Hallo Thilo und Timm,

vielen Dank für Eure Antworten.

Zitat von: paramecium in März 05, 2018, 22:52:51 NACHMITTAGS
Das Problem der "Vitalfärbung" ist und bleibt, dass sie nicht vital erfolgt. Die so genannten Vital-Farbstoffe bleiben in dieser Konzentration toxischer, als wenn man Fluorchrome in dieser Konzentration verwenden wollte.

Die Färbung bei den Strudelwürmern erfolgte am 3.1.2018 und die Tiere sind immer noch am Leben (und gefärbt). Ich denke daher schon, dass die Färbung vital genannt werden kann. Wenn die Tiere bis dahin überleben, werde ich das Präparat am Samstag zur Kornrade mitbringen.
Die Intensität einer Färbung ist eigentlich immer proportional zum Produkt aus Farbstoffkonzentration und Färbezeit. Durch die Verwendung der Mikroaquarien kann ich problemlos mehrere Tage Färbezeit bei kleinsten Konzentrationen einhalten. Ich denke, dass eine solche Prozedur für die Tiere meist weniger belastend ist und die Überlebenschance steigt.
Prinzipiell hast Du natürlich Recht: Fluoreszenz-Mikroskopie ist aussagekräftiger und selektiver als die klassischen Farbstoffe - sowohl bei Vitalfärbung als auch bei der Färbung fixierter Objekte. Deine bemerkenswerten Ergebnisse zeigen das zur genüge. Aber für viele Beobachtungen ist die klassische Färbung entweder einfacher oder standardisierter. Das Hauptproblem bei der Vitalfärbung bleibt bei allen Färbemethoden gleich: Durch die biologischen Vorgänge, die man hierbei ja gerade beobachten will, ändert sich das Färbeergebniss mit der Zeit. Beim obigen Beispiel werden gefärbte Zellen abgebaut, neue entstehen. Die Zellen werden nicht gleichmäßig gefärbt, sondern nur Teile (in diesem Fall die Rhabditen). Die Interpretation der Färbung ist daher oft recht problematisch.

Das Problem mit dem Methylenblau war nicht, das der Farbstoff prinzipiell sehr toxisch ist. Während meiner Versuch wurde der "Beifang" - z.B. Ciliaten und Flagellaten - durch den Farbstoff augenscheinlich nicht geschädigt. Lediglich die Strudelwürmer vertrugen das Methylenblau nicht und waren für diesen Farbstoff sehr empfindlich, während sie durch andere Farbstoffe offensichtlich problemlos vital gefärbt werden können.

Viele Grüße

Michael
Gerne per Du