Botanik: Erstversuch (Wilder Wein)

[othum]

Hallo zusammen,

ich hatte mich ja die Tage als Neuling geoutet (https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=32126.0), nun trau ich mich, mein Erstlingswerk zu zeigen....

Das ist in mehrerer Hinsicht Premiere: Meine ersten Schnitte mit dem Handikrotom, meine ersten selbst gefärbten Pflanzenschnitte und die ersten hier gezeigten Bilder..... Klar, dass das noch nicht perfekt sein kann. Ich zeige es trotzdem (inklusive Mängel) und würde mich über Kommentare, Hinweise und vor allem Verbesserungsvorschläge freuen.

Da ich kein Biologe und schon gar kein Botaniker bin, erspare ich mir eine detaillierte Beschreibung der Probe. Es handelt sich um eine Variante des Wilden Weins (Parthenocissus quinquefolia) aus meinem eigenen Garten. https://de.wikipedia.org/wiki/Selbstkletternde_Jungfernrebe

Die Probe habe ich gewählt, weil für mich gut verfügbar und hier scheinbar noch nicht gezeigt 

Alle Aufnahmen an einem inversen Zeiss Axiovert S100 mit HAL100 Durchlicht und HBO100 Auflicht, HF/DIC/PH Kondensor NA=0.55, als Kamera eine Pentax K-1 (Vollformat dSLR) über Trinokulartubus mit 2.5* Projektiv angeschlossen. RAW Aufnahmen in Lightroom entwickelt, mit Helicon Focus gestackt, wenn nötig mit PTGui gestitcht, zurück in LR beschnitten, verkleinert und als JPG exportiert, bzw mit krpano ein interaktives Panorama erstellt.

Zunächst ein etwas dickerer Schnitt (100µm), Primärfluoreszenz im Auflicht (HBO 100, KP 546nm, FT 580nm, LP 590nm), Zeiss A-Plan 5x/0.12:

http://www.thum.li/NMZ/WW_01.jpg

Dann einen 50µm Schnitt in W3AsimII gefärbt, Sekundärfluoreszenz (Methode wie oben), Stack aus 12 Bildern, 5 µm Abstand:

http://www.thum.li/NMZ/WW_02.jpg

Der gleiche Schnitt, Übersichtsaufnahme im Durchlicht (Hal100, Zeiss A-Plan 5x/0.12, Stack aus 12 Bildern, 5 µm Abstand):

http://www.thum.li/NMZ/WW_03.jpg

Klcken auf den nächsten Link lohnt sich! (Finde ich ) Höher aufgelöst als interaktives Panorama (Hal100, Zeiss LD-Achroplan 20x/0.40 korr. PH2, Panorama aus 15 Stapeln, jeweils etwa 30 Bilder, 2 µm Abstand):
http://www.thum.li/NMZ/WW_03a/

Und noch eine Detailaufnahme (Hal100, Zeiss LD-Achroplan 40x/0.60 korr. PH2, Stack aus 30 Bildern, etwa 0.8 µm Abstand):

http://www.thum.li/NMZ/WW_04.jpg


Ein paar Probleme sind mir schon selber aufgefallen:
Ich habe bewusst die Flecken im Hintergrund (gefärbte Zellfragemnte, etc.) nicht entfernt um zu zeigen, wie es "roh" aussieht.
Luftblasen: wie vermeiden, vor allem in Wasser bei frischen Schnitten zur Untersuchung der Primärfluoreszenz?
Eindecken: Ich hab jetzt für den Anfang für die gefärbten Proben Glycerin genommen, da fluoreszenztauglich, farberhaltend und sofort verwendbar. Alternativen? Idealerweise solche, bei denen man nicht 7 Tage aushärten muss....
Die Farben kommen mir recht flau vor. Der Weissabgleich liefert für die Lampe auch nur etwa 2000K. Ist das normal oder ein Zeichen, dass ich mal ne neue Lampe brauche?

Vielen Dank im Voraus für Eure Kommentare, jetzt hoffe ich nur, dass auch alle Links funktionieren...

cu Oliver

PS: Werde vermutlich bald auch die erste Anzeige unter "Suche" aufgeben.....

[Fahrenheit]

Lieber Oliver,

es freut mich, einen neuen Pflanzenschnippler im forum zu haben! Für den Anfang schaut das doch gar nicht so schlecht aus.

Um unterstützen zu können, wäre es aber gut, das komplette Präparationsprotokoll zu haben, also wie dick sind die Schnitte, womit und wie lange hast du fixiert, wie hast du gespült und gefärbt (auch wieder womit und wie lange ...) etc.

Das Vermeiden von Luftblasen bei der Wassereindeckung ist nicht ganz einfach. Versuche es mal mit abgstandenem Aqua dest und vorsichtigem Spülen nach dem Färben, die Schnitte müssen immer komplett im Wasser sein, auch beim Transport auf den Objektträger und dem Eindecken.

Herzliche Grüße
Jörg

p.s.
Färbungen auch der gleichen Pflanzen fallen teils sehr unterschiedlich aus, was von den verschiedensten Faktoren abhängt. Ein Beispiel anhand der Gewöhnlichen Jungfernrebe findest Du hier im Forum:
https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=10848.0

Der Thread ist was länger, beim ersten Versuch hatte ich mit W3A wirklich fantastische Farben an einem älteren Spross am Ende der Wachstumsperiode, beim versuch etwas ähnliches mit W3asim II hin zu bekommen, habe ich im Sommer ein eher langweiliges Präparat erhalten.

[othum]

Hallo Jörg,

danke für die Kommentare.

Hier noch ein paar Ergänzungen:
Für die Primärfluoresenz wurden frische Schnitte (100µm, Handmikrotom, Leica 818, SHK Halter [Danke, Detlef!]) in Wasser überführt und zügig mikroskopiert, dabei natürlich in Wasser eingedeckt.

Zum Färben wurden die Schnitte (50µm) in 70%EtOH für eine Stunde fixiert, schrittweise In Wasser überführt und dann in W3AsimII (4:1:1; 1:5 verdünnt mit H2O) für 6 Min gefärbt (inklusive Erwärmen). Dann kurz 3 mal mit Wasser gespült und 3 mal mit reinem iPrOH. Also ziemlich genau wie hier: http://www.mikroskopie-bonn.de/bibliothek/botanische_mikrotechnik/162.html beschreiben. Dann in Glycerin eingedeckt.

Ich weiss, dass man eigentlich in AFE fixiert. Als Chemiker bin ich auch recht schmerzfrei im Umgang mit Chemikalen, würde aber gerne zu Hause im Keller den Umgang mit Formaldehyd vermeiden. Unabhängig davon, dass man das nur schwer bekommt.....


cu Oliver

[Klaus Herrmann]

Hallo Oliver,

gratuliere zum Erstversuch, das sieht doch schon richtig gut aus. Wein hat Jörg ja schon ausführlich und perfekt dokumentiert, ich hatte ihn auch schon vor Jahren hier gezeigt. Detlef hat damals den Schnitt botanisch korrekt beschriftet, füge ich, wenn du einverstanden bist hier an.

3 mal mit reinem iPrOH.(gespült)  Dann in Glycerin eingedeckt.

Da bist du ganz zum Schluss vom guten Weg abgewichen; nach Isoprop hättest du in Euparal eindecken können  - hat nur den Nachteil der Eigenfluoreszenz, aber sonst nur Vorteile.

AFE ist schon das klassische Mittel für botanische Proben und die Lebensgefahr ist nicht so groß. Die Pathologen werden alle biblisch alt und baden buchstäblich in Formaldehyd.
Solltest du Beschaffungsprobleme haben für Färbelösungen oder Chemie kannst du dich gerne an mich wenden. Chemiker werden von mir bevorzugt bedient!

[othum]

Hallo Klaus,

auch Dir vielen Dank.

Zu dem Glycerin bin ich über diesen Thread gekommen:
https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=10309.msg73960#msg73960
Danach sah das gar nicht so schlecht aus, auch in Kombination mit W3AsimII...

Generell wirkt mir der Schnitt zu blau, vielleicht versuche ich doch mal die klassische Wackerfärbung. Oder gibt es da beim Simultanfärben noch kleinere Tricks???

Und wegen dem Formalin bekommst Du eine PN 

cu Oliver

[othum]

Man sollte vielleicht nicht versuchen, noch direkt die Ergebnisse zu posten ....

Ich habe mir die Schnitte nach 24h nochmal angeschaut. Und siehe da: die Luftblasen sind weg und auch die Farben gefallen mir schon deutlich besser (jetzt kann man sogar einen Hauch von grün erahnen....).
Das kommt zwar immer noch nicht an Jörgs Beispiele ran, aber es wird besser. Mich hatte auch das Fehlen der Sklerenchymkappen gewundert, bis mir aufgefallen ist, dass mein Trieb deutlich dünner und damit jünger war und wahrscheinlich einfach noch kein Sklerenchym gebildet wurde. Gleiches gilt für das fehlende Phloem aussen....


Hier die neuen Bilder (gleicher Schnitt wie gestern, 24h in Glycerin eingedeckt):

Übersicht: Zeiss A-Plan 5x/0.12, Stack aus 12 Bildern, 5 µm Abstand


Aussschnitt: Zeiss LD-Achroplan 20x/0.40 korr. PH2, 20 Bilder, 2 µm Abstand


Ausschnitt: Zeiss LD-Achroplan 40x/0.55 korr. PH2, 30 Bilder, 0,7 µm Abstand


Und ich bin natürlich immer für weitere Tipps und Verbesserungsvorschläge offen

cu Oliver

[Detlef Kramer]

Lieber Oliver,

was meinst Du mit "Phloem außen"? Das Phloem sitzt, wohl augebildet, genau da, wo es hingehört, nämlich über dem Kambium, das ebenfalls gut zu erkennen ist. Nb.: vergesst bitte nicht, dass der Wilde Wein kein Wein ist. Vergleiche sind da nicht unbedingt möglich.

Herzliche Grüße
Detlef

[othum]

Hallo Detlef,

Tippfehler. Ich meinte natürlich das Phellem.....
Und der Vergleich bezieht sich auf die von Jörg verlinkte gewöhnliche Jungfernrebe, die ist ja schon recht "nah dran ".

Beste Grüße, Oliver