BOTANIK: Olea europaea (Olivenbaum) und ein paar Fragen.... *

[othum]

Liebe Mikroskopie-Freunde,

Hans-Jürgen hat ja hier zuletzt einen sehr schönen Beitrag über den Olivenbaum gezeigt:
https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=32609.msg240692#msg240692

Kurz vorher war ich ebenfalls auf diese Idee gekommen, um meine Fortschritte im „Schnippeln“ hier mal zu zeigen und um einige Fragen loszuwerden, bzw. Anregungen einzusammeln (dazu unten mehr).
Da ich nicht mit Hans-Jürgens Qualität mithalten kann, habe ich meine Bilder nicht einfach dazu gehangen sondern mache einen neuen Thread auf….

Daher hier meine Werke. Zwischendurch habe ich ein paar Fragen versteckt, bei denen ich mich über Antworten freuen würde. Genauso über jegliche Form von Kommentaren und Verbesserungsvorschlägen!
Für die Freunde höher aufgelöster Bilder habe ich zwischendurch noch zwei Links zu „zoombaren“ Bildern in voller Auflösung untergebracht...

Methoden:
Die Proben stammen aus einem etwa 2m hohen Baum in meinem eigenen Garten (der dort seit etwa 10 Jahren eingepflanzt steht). Geschnitten wurde mit einem HN40 Schlittenmikrotom mit Leica Einmalklingen auf 30µm Schnittdicke.

Die ungefärbten Schnitte wurden 3x in Wasser gewaschen und dann mikroskopiert.
Ansonsten wurden die Schnitte 3x in Wasser, 3x in 30% EtOH gewaschen, zurück in Wasser überführt und  in W3Asim I gefärbt (7 Min mit einmaligem Erwärmen), mit Wasser gewaschen, in iPrOH überführt und in Euparal eingedeckt und im Wärmeschrank bei 50°C ausgehärtet.

Verwendet wurde ein Zeiss Axiovert S100, DL-Halogenbeleuchtung mit KB15 Filter, bzw. HBO100 zur AL-FL mit IR Sperrfilter und Blauanregungs-Filtersatz (BP450-490; FT 510, [EDIT:] LP515 BP515-565), Trinokulartubus mit 2.5x Projektiv zur Ausleuchtung des „Vollformats“. Als Kamera dient eine Pentax K-1 (36MPx Vollformat), Aufnahmen im RAW Format.
Objektive: A-Plan 5x/0.12; EC-Plan-Neofluar 10x/0.30; LD-Achroplan 20x/0.40 Korr. Ph2; EC Plan Neofluar 40x/0.75.

Die Aufnahmen wurden in Lightroom CC Classic entwickelt (Weissabgleich, Belichtungskorrektur, ggf. Sensorflecken entfernt), auf 9MPx verkleinert und als TIFF exportiert. Gestackt wurde mit Helicon Focus Pro 6.8.0 (Methode B), gestitcht mit PTGui Pro 11.9. In Photoshop CC wurde ggf. freigestellt und der Massstab eingefügt. Zurück in Lightroom wurde geschärft und fein geschliffen sowie als JPG exportiert. Die hochaufgelösten Webversionen wurden mit krpano 1.19 erstellt.

Anfangen möchte ich mit Schnitten, die relativ am Ende des Sprosses gemacht wurden (ca. 5cm von der Spitze). Wie erwartet im einfachen HF oder DF recht langweilig (A-Plan 5x/0.12):
Bild 1:

Bild 2:




Auch im Phasenkontrast (LD-Achroplan 20x/0.40 Korr. Ph2) nicht viel zu sehen:
Bild 3:




Um mal wenigstens etwas Neues gegenüber Hans-Jürgens Beitrag zu zeigen, hier Primärfluoreszenz im AL (A-Plan 5x/0.12; EC-Plan-Neofluar 10x/0.30; EC Plan Neofluar 40x/0.75):
Bild 4:


Bild 5:


Bild 6:


Bild 7:




Hier ein erster gefärbter Schnitt (A-Plan 5x/0.12) und meine erste Frage als Nicht-Biologe und "Schnippel"-Anfänger:
Bild 8:


Bild 9:


Was sind das für Flecken in den Zellen des Marks? Sind das nicht ausgewaschene Zellinhalte (Plastiden?)? Wenn ja, warum sind sie nur in manchen Zellen? Später (z.B. Bild 14/15) werden das noch deutlich mehr… Und was kann man dagegen tun?



Dann das Ganze in AL-Fluoreszenz (A-Plan 5x/0.12; EC-Plan-Neofluar 10x/0.30; EC Plan Neofluar 40x/0.75). Ist natürlich in Euparal nicht optimal (dazu später mehr), daher mit fragwürdigem Weissabgleich…:
Bild 10:


Bild 11:


Bild 12:


Bild 13:

Meine Frage: Bei Hans Jürgen sehen die Farben doch deulich anders aus. Liegt das an der verwendeten anderen Lichtquelle oder den etwas kurzwelligeren Filtern? Oder händischer Weissabgleich auf eben nicht Neutralgrau?




Ein weiterer Schnitt von einem anderen Trieb, noch etwas weiter Richtung Spitze des Triebs (A-Plan 5x/0.12; EC-Plan-Neofluar 10x/0.30). Hier sind die „Flecken“ in den Zellen noch viel deutlicher!
Bild 14:


Bild 15:


Aber hier auch ein erste „zoombare“ Version:
http://www.thum.li/Mikro/Olea/15/index.html



Und vier Ausschnitte mit dem 40er (auf denen man aber nicht viel mehr sieht, als in der zoombaren Version oben):
Bild 16:


Bild 17:


Bild 18:


Bild 19:




Und noch einmal DF, für mich ästhetisch eigentlich die schönsten Aufnahmen…
Bild 20:




Nun ein Schnitt durch einen Blattansatz (A-Plan 5x/0.12), leider vom Schnitt her nicht so gelungen:
Bild 21:


Bild 22:




Einige Zentimeter weiter von der Spitze entfernt sehen die Schnitte doch recht anders aus (A-Plan 5x/0.12; EC-Plan-Neofluar 10x/0.30; EC Plan Neofluar 40x/0.75). Durch Wachstum ist aus der ovalen Form eine annähernd runde (oder doch quadratisch?) geworden. An dieser Stelle fällt das Schneiden deutlich schwerer, die Rinde ist äußerst robust und die Ausbeute an brauchbaren Schnitten sinkt (zumindest bei mir), deshalb hier auch ein 40µm Schnitt:
Bild 23:


Bild 24:


Bild 25:


Bild 26:


Bild 27:





Auch hier wieder ein paar FL Aufnahmen. Zunächst eine Übersicht (EC-Plan-Neofluar 10x/0.30)
Bild 28:


Und in hoch aufgelöst, „zoombar“:
http://www.thum.li/Mikro/Olea/28/index.html



Und zwei Ausschnitte mit dem 40er:
Bild 29:


Bild 30:




Um das Problem des schwierigen Weissabgleichs in Euparal anzugehen, habe ich mal ein paar Alternativen probiert.
Hier ein (nicht besonders gut gelungener) Schnitt nach dem Färben und waschen, VOR dem Transfer ins iPrOH (man sieht noch recht viel Acridinrot) und dann in Wasser eingedeckt:
Bild 31:




Besser werden die Fluoreszenzaufnahmen überraschenderweise (jedenfalls für mich) nicht:
Bild 32:


Bild 33:


Bild 34:




Ein weiterer (ebenfalls nicht gut gelungener) Schnitt nach Transfer in iPrOH und Eindecken in Glycerin (Acridinrot deutlich ausdifferenziert):
Bild 35:


Bild 36:


Bild 37:


Bild 38:




Man kann sich einbilden, etwas „schönere“ Farben zu sehen und ein größeres Farbspektrum zu nutzen…. Zumindest mit dem 40er messe ich im Hintergrund auch eine deutlich höhere Farbtemperatur…. 
Auch hier bin ich für Tipps zu Alternativen sehr dankbar!


Viel Spaß beim Betrachten, wie gesagt: Ich freue mich über Anregungen, Kommentare und Verbesserungsvorschläge!

cu Oliver
[EDIT: Bildnummern eingefügt]

[liftboy]

Hallo Oliver,

herrliche Schnitte zeigst Du da. Auch wenn ich nichts dazu sagen kann, - da müsstest Du Detlef oder Jörg fragen.

Grüße
Wolfgang

[Klaus Herrmann]

Hallo Oliver, nicht nur für den Anfang gelungen.

 Aber die Farben der Auflichtfluoreszenzaufnahmen finde ich seltsam. Was sind denn das für Filterblöcke?

Sorry gerade gesehen, Blau-Anregung, dann aber besonders irritierend.

Das ist Wacker mit Blauanregung bei mir.

[othum]

Hallo Klaus,

Hallo Oliver, nicht nur für den Anfang gelungen.

Danke!

Aber die Farben der Auflichtfluoreszenzaufnahmen finde ich seltsam. Was sind denn das für Filterblöcke?

Sorry gerade gesehen, Blau-Anregung, dann aber besonders irritierend.

Das ist Wacker mit Blauanregung bei mir.

Genau das verwirrt mich ja. Was für ein Eindeckmittel ist das bei Dir? Ist der Hintergrund tatsächlich schwarz? Welche Farbtemperatut hat Dein Weissabgleich?

Danke im Voraus für die Antworten....

cu Oliver

[Fahrenheit]

Lieber Oliver,

zunächst: die Schnitte und Färbungen sind Dir wirklich gut gelungen und auch die Aufnahmen sind klasse!

Zu den Fluoreszenzfarben kann ich leider nichts sagen, aber zu den Strukturen im Mark fallen mir anhand Deiner Bilder zwei Möglichkeiten ein:

1. Es könnte sich um Stärkekörner (Amyloplasten) und / oder deren Kristallisationskeime handeln.
Am Sprossende macht die Einlagerung im Mark am Ende der Wachstumsperiode Sinn, dann kann es mit den ersten warmen Sonnenstrahlen gleich wieder los gehen.
Amyloplasten zeigen im polarisierten Licht Doppelbrechung und lassen sich mit Lugolscher Lösung schwarzblau anfärben und somit nachweisen.

2. Präparationsartefakte
Es könnte sich auch um Präparationsartefakte handeln, da das dreimalige Spülen mit 30% Ethanol nicht ausreicht, um den Schnitt zu fixieren.
Eine Schnittfixierung sollte zumindest mit Ethanol 70% für 20 Minuten erfolgen. Länger ist besser, mehr als 24h macht keinen Sinn. Wenn möglich AFE fixieren, da die zusätzlich enthaltene Essigsäure die beim Entwässern geschrumpften Zellwände wieder etwas aufquellen lässt und das Formaldehyd Eiweisse, also vor allem pflanzliche Enzyme denaturiert.

Um anhand von Fotos mehr sagen zu können, wären Aufnahmen mit dem 40er oder 100er Objektiv, möglichst vom frischen Schnitt und im Pol nicht schlecht.

Vielleicht hilft Dir der unten verlinkte Artikel zur Erstellung Pflanzlicher Dauerpräparate auf der Webseite des MKB weiter:
http://www.mikroskopie-bonn.de/themenseiten/erstellung_pflanzlicher_dauerpraeparate/index.php

Für Pflanzenschnippler ein Muss: das Praktikumsbuch von Gerhard Wanner:
http://www.mikroskopie-bonn.de/literatur/index.html#a223

Herzliche Grüße
Jörg

p.s.
Ich habe Deinen Beitrag in die Liste Botanik übernommen.

[othum]

Lieber Jörg,

Lieber Oliver,

zunächst: die Schnitte und Färbungen sind Dir wirklich gut gelungen und auch die Aufnahmen sind klasse!

Danke!

Zu den Fluoreszenzfarben kann ich leider nichts sagen, aber zu den Strukturen im Mark fallen mir anhand Deiner Bilder zwei Möglichkeiten ein:

1. Es könnte sich um Stärkekörner (Amyloplasten) und / oder deren Kristallisationskeime handeln.
Am Sprossende macht die Einlagerung im Mark am Ende der Wachstumsperiode Sinn, dann kann es mit den ersten warmen Sonnenstrahlen gleich wieder los gehen.
Amyloplasten zeigen im polarisierten Licht Doppelbrechung und lassen sich mit Lugolscher Lösung schwarzblau anfärben und somit nachweisen.

Danke für die Hinweise. Das würde zumindest zu der Tatsache passen, dass die Strukturen um so ausgeprägter werden, je näher am Ende des Sprosses die Probe genommen wurde. Probenmaterial ist ja hinreichend vorhanden  , im Zweifelsfall auch noch nächstes Jahr zu einer anderen Wachstumsperiode.
Pol-Einrichtung habe ich leider keine, Lugolsche Lösung sollte nicht das Problem sein...

2. Präparationsartefakte
Es könnte sich auch um Präparationsartefakte handeln, da das dreimalige Spülen mit 30% Ethanol nicht ausreicht, um den Schnitt zu fixieren.
Eine Schnittfixierung sollte zumindest mit Ethanol 70% für 20 Minuten erfolgen. Länger ist besser, mehr als 24h macht keinen Sinn. Wenn möglich AFE fixieren, da die zusätzlich enthaltene Essigsäure die beim Entwässern geschrumpften Zellwände wieder etwas aufquellen lässt und das Formaldehyd Eiweisse, also vor allem pflanzliche Enzyme denaturiert.

Ich vergaß zu schreiben, dass die ersten Präparate (Bilder 1-13) von einer Probe stammen, die 2 Wochen in AFE fixiert wurde; der Rest sind frische Proben. Aber auch in der ersten Probe zeigen sich diese "Einlagerungen"

Um anhand von Fotos mehr sagen zu können, wären Aufnahmen mit dem 40er oder 100er Objektiv, möglichst vom frischen Schnitt und im Pol nicht schlecht.

Wie gesagt, Pol kann ich leider nicht...

Vielleicht hilft Dir der unten verlinkte Artikel zur Erstellung Pflanzlicher Dauerpräparate auf der Webseite des MKB weiter:
http://www.mikroskopie-bonn.de/themenseiten/erstellung_pflanzlicher_dauerpraeparate/index.php

Schon lange "gebookmarked"  Wenn es endlich mal zeitlich passt, komme ich auch mal zu den Treffen an meiner Alma Mater....

Für Pflanzenschnippler ein Muss: das Praktikumsbuch von Gerhard Wanner:
http://www.mikroskopie-bonn.de/literatur/index.html#a223

Ist natürlich auch schon vorhanden 

p.s.
Ich habe Deinen Beitrag in die Liste Botanik übernommen.

Welche Ehre!

cu Oliver

[Hans-Jürgen Koch]

Lieber Oliver,

die Schnitte und die W3Asim I – Färbung sind super.
Ich arbeite mit der W-3A-Färbung nach Wacker (Acridinrot-Acriflavin-Astrablau), damit kann ich die einzelnen Farben besser differenzieren.
Meine Pflanzen - Proben werden immer mit dem AFE – Gemisch fixiert und dann geschnitten.
Das Schneiden und das Färben der Proben ist immer eine Übungssache.

Frohe Weihnachten wünscht

Hans-Jürgen

[Klaus Herrmann]

Hallo Oliver,

üblicherweise decke ich in Euparal ein, das leider ein grüne Eigenfluorseszenz hat. Deshalb mache ich immer etwas Unterbelichtung, aber ein Restschimmer grün bleibt doch noch. Weißabgleich lasse ich die Kamera machen. Funktioniert eigentlich ganz ordentlich. Visuelles Bild und Foto passen ganz gut zusammen. Aber lass dich nicht irritieren durch mein Gemotze, die Ergebnisse können sich in jeder Hinsicht sehen lassen.

Vielleicht stimmt ja was mit deinem Filterblock nicht? Sehe gerade: BP450-490; FT 510, BP515-565 das ist als Sperrfilter ein schmalbandiger Bandpass, besser wäre ein Langpass LP 520, der ist dann nach hinten offen.
Bei 565 schneidest du ja schon gelb, orange, rot ab

[othum]

Hallo Klaus,

Hallo Oliver,

üblicherweise decke ich in Euparal ein, das leider ein grüne Eigenfluorseszenz hat. Deshalb mache ich immer etwas Unterbelichtung, aber ein Restschimmer grün bleibt doch noch. Weißabgleich lasse ich die Kamera machen. Funktioniert eigentlich ganz ordentlich. Visuelles Bild und Foto passen ganz gut zusammen. Aber lass dich nicht irritieren durch mein Gemotze, die Ergebnisse können sich in jeder Hinsicht sehen lassen.

Keine Sorge. ich lass mich nicht irritieren. Im Gegenteil, ich suche ja selber Vorschläge für Verbesserungen!

Vielleicht stimmt ja was mit deinem Filterblock nicht? Sehe gerade: BP450-490; FT 510, BP515-565 das ist als Sperrfilter ein schmalbandiger Bandpass, besser wäre ein Langpass LP 520, der ist dann nach hinten offen.
Bei 565 schneidest du ja schon gelb, orange, rot ab

Habe gerade nochmal nachgeschaut. Da hatte sich ein Fehler in meine Unterlagen eingeschlichen. Es ist ein LP515 statt dem BP Filter (sonst würde man in der Primärflureszenz auch nicht das Rot so gut sehen....) Der BP Filter wäre der lt. Handbuch zu dem Filterset gehörende gewesen...... Werde ich oben auch noch korrigieren....

cu Oliver

[Klaus Herrmann]

Hallo Oliver,

Es ist ein LP515 statt dem BP Filter (sonst würde man in der Primärflureszenz auch nicht das Rot so gut sehen....) Der BP Filter wäre der lt. Handbuch zu dem Filterset gehörende gewesen...... Werde ich oben auch noch korrigieren....

Dann sind die Fluoreszenzfarben für mich rätselhaft. Wenn du magst, dann kannst du mir einen Schnitt schicken und ich mach mal eine Fluoreszenzaufnahme davon. Bekommst du wieder zurück - ich hab schon einige Präparate  Irgendwie muss man den Haken doch finden.

[othum]

Hallo Klaus,

Hallo Oliver,
Dann sind die Fluoreszenzfarben für mich rätselhaft. Wenn du magst, dann kannst du mir einen Schnitt schicken und ich mach mal eine Fluoreszenzaufnahme davon. Bekommst du wieder zurück - ich hab schon einige Präparate  Irgendwie muss man den Haken doch finden.

Vielen Dank für das Angebot; ich werde darauf zurück kommen. Es geht doch nichts über einen Ringtest 

Ich habe mir nochmal Dein Bild, Hans-Jürgens Bild und meine angeschaut. Dabei bin ich zu ein paar Schlüssen gekommen:

Dein Bild zeigt deutlich mehr rot, ist aber auch deutlich überbelichtet. Vielleicht brauchst es einfach eine längere Belichtung, um diese Rotfärbung herauszuarbeiten?

Hans-Jürgens Fluoreszenz-Bilder zeigen hingegen überhaupt kein Rot, sondern nur grün! Vielleicht färbt der Olivenbaum einfach anders an?
https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=32609.msg240694#msg240694

Schliesslich habe ich mich nochmal meinem Workflow gewidmet und nochmal etwas mit Bild 36 gespielt.


Der Hintergrund meiner Aufnahmen zeigt deutlich eine gelb-grün Färbung:

Das ist jetzt schon nach etwas modifiziertem Weissabgleich, nach dem Stacken und Stitchen, allerdings nur ein Ausschnitt.

Man sieht auch die etwas ungleichmäßige Beleuchtung. Wie an anderer Stelle geschrieben, ist ja bei mir eine Kondensorlinse hinüber, so dass ich die AL-Einheit ohne diese Linse betreibe...
https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=32312.msg238892#msg238892
Es könnte natürlich sein, dass das zu erhöhtem Streulicht führt...

Nach Freistellen und Aufhübschen in PS sieht das dann so aus: Das kommt dem optischen Eindruck im Minkroskop schon deutlichnäher


Und wer es höher aufgelöst mag:
http://www.thum.li/Mikro/Olea/36a/index.html

cu Oliver

[Rolf-Dieter Müller]

Hallo Oliver,

ein sehr schöner Schnitt und eine gelungene, ausdifferenzierte Färbung. Gefällt mir richtig gut.

Bei den Fluoreszenzaufnahmen ist mir, solltest Du wirklich mit Blauanregung und dem angegebenen Filtersatz gearbeitet haben, zu viel Blau drin. Das sieht ja schon fast nach UV-Anregung aus. Bei Blauanregung dürft kein Blau zu sehen sein, wie Du es ja auch sehr schön mit den letzten beiden Bildern (Nr. 37 und 38) zeigst.

Viele Grüße,
Rolf-Dieter

[othum]

Hallo Rolf-Dieter,

Hallo Oliver,

ein sehr schöner Schnitt und eine gelungene, ausdifferenzierte Färbung. Gefällt mir richtig gut.

Danke für die Blumen!

Bei den Fluoreszenzaufnahmen ist mir, solltest Du wirklich mit Blauanregung und dem angegebenen Filtersatz gearbeitet haben, zu viel Blau drin. Das sieht ja schon fast nach UV-Anregung aus. Bei Blauanregung dürft kein Blau zu sehen sein, wie Du es ja auch sehr schön mit den letzten beiden Bildern (Nr. 37 und 38) zeigst.

Ich hatte eben, in Antwort auf Klaus' Kommentar, nochmal eine neue Version von Bild 36 gepostet. Ich denke, das geht in genau in die von Dir angesprochene Richtung. Das Problem liegt wohl im Weissabgleich, aber ich werde da noch ein bisschen weiter rumoptimieren. Der Schnitt in Glycerin (36) gefällt mir jetzt schon besser, mal sehen, ob ich das mit den Euparal-Schnitten auch hinbekomme.

cu Oliver

[Rolf-Dieter Müller]

... Das Problem liegt wohl im Weissabgleich, aber ich werde da noch ein bisschen weiter rumoptimieren.   ...

Hallo Oliver,

das habe ich schon hinter mir, denn meine Kamera kommt mit dem manuellen Weißabgleich bei Fluoreszenzaufnahmen nicht zurecht.

Deshalb stelle ich einen feststehenden Weißabgleich, der im Ergebnis möglichst nah am visuellen Bildeindruck ist, ein. Bei meiner Kamera ist es die Einstellung "Glühlampenlicht" und danach mit der Bildverarbeitung den Blaukanal löschen.

Viele Grüße,
Rolf-Dieter

[koestlfr]

Hallo Oliver!

Sehr gute Schnitte, gute Färbung - tolle Bilder!

Bei Dir ist, wie Rolf-Dieter schon geschrieben hat, sicher ein Fehler beim Weißabgleich passiert? Du hast die Bilder doch ohnehin im RAW-Format …

Ich habe auf die Schnelle einen Ausschnitt aus einem Radialschnitt der Olea (auch mit W3A gefärbt) gefunden, der farblich stimmen dürfte.



Liebe Grüße
Franz

PS @ Klaus: dein Bild ist, meiner Meinung nach, immer noch überbelichtet usw. …