Reißende Paraffinschnitte

Begonnen von Alf, Juni 21, 2019, 09:30:18 VORMITTAG

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Alf

Hallo!

Ich habe nun meine ersten Präparate in Paraffin eingebettet, es gibt nur ein Problem. Beim Schneiden am Rotationsmikrotom ergeben sich keine schönen Schnitte, sondern sie reißen immer beim Schneiden durch das Gewebestück und sie falten sich ein, sodass sich keine guten Schnitte ergeben. Am Mikrotom, oder am Messer liegt es nicht, denn wenn ich einfach nur, probeweise, einen leeren Paraffinblock schneide, erhalte ich schöne Serienschnitte auch bei 1 um problemlos.

Das Stückchen Niere wurde für jeweils 24h in 50%, 70%, 85%, 96% Brennspiritus, 2x 100% Isopropanol, 100% n-Butanol entwässert und nach 12h Paraffin-Butanol bei 60°C und 2x 4h Paraffin bei 60°C, eingebettet.

Das Stück war recht klein und dünn deshalb habe ich mir gedacht es reichen kürzere Zeiten im Paraffin. Kann es sein, dass die Zeit im Paraffin einfach zu kurz war?

LG,
Alf

Florian Stellmacher

Moin Alf,

dass die Schnitte am leeren Block astrein sind, bedeutet, dass die üblichen Fehlerquellen wohl ausgeschlossen sind, und das Problem im Material liegt.

Risse entstehen i.d.R. durch Scharten im Messer oder auch durch einen zu flachen Inklinationswinkel des Messerhalters. In Deinem Falle dürfte das Material harte Stellen aufweisen, von dem sich Material an der Klinge absetzt und dann durch den Schnitt gezogen wird. Nierengewebe sollte eigentlich halbwegs schneidbar sein, sofern keine Konkremente oder Verkalkungen vorliegen.

Du hast das Gewebe extrem lange in den jeweiligen Stufen gelassen. Ich tippe mal, dass Dir das Material, obwohl es natürlich immer in einem flüssigen Medium war, trocken und hart geworden ist. Dann dringt das Paraffin nicht mehr adäquat ins Gewebe ein, und der Schnitt splittert auf. Der häufigste Grund ist sicher eine zu schnelle und insuffiziente Entwässerung, in Deinem konkreten Fall nehme ich an, dass das Nierengewebe, das recht salzig ist, vielleicht zu kurz fixiert/gespült und anschließend zu lange "gegart" wurde. Letztlich weiß ich es natürlich nicht.

Ich habe keinerlei Erfahrung mit der Butanol-Methode, sondern verwende Xylol und ohne Verdünnung im Anschluss gleich Histowachs. Das erscheint mir einfacher, schneller und hat sich in der Pathologie seit über 100 Jahren bewährt. Die Butanol-Methode soll bessere Ergebnisse liefern, einen Beweis dafür habe ich aber noch nicht gesehen. Ultima Ratio wäre, mit einer stumpfen Sonde in den Block zu stechen und zu gucken, wie trocken das Zeug ist. Die Konsistenz sollte sich nicht wesentlich von Paraffin unterscheiden.

Wegen der Zeitvorgaben: In der Routinediagnostik verwenden wir Einbettautomaten, die nachmittags gestartet werden und aus denen am Folgetag früh morgens das infiltriete Gewebe entnommen wird. Die Blöcke werden dann gegossen, und wenn ich um 8°° Uhr zur Arbeit komme, ist das Meiste schon fertig. Die Gewebsstücke sind häufig sehr viel größer als von Dir beschrieben (was halt so in die Kapsel passt ...) , und das geht problemlos. Kleine Biopsien kann man sogar noch am selben Tag schnelleinbetten und den Block gießen sowie die Schnitte machen.

Paraffin-Histologie ist ein phantastisches Feld, und wenn es erstmal läuft, dann läufts. Kopf hoch, beim nästen Mal klappt's!

LG Florian

Vorwiegende Arbeitsmikroskope:
Zeiss Axioskop 2
Olympus BHS (DL, Pol, Multidiskussionseinrichtung)
Zeiss Axiophot (DIK und AL-Fluoreszenz)
Zeiss Axiovert (Fluoreszenz)
Wild M400 Fotomakroskop (DL, DF, AL, Pol)

Jürgen H.

Alf, versuche einmal, Deinen wahrscheinlich überprozessierten Block einige Minuten auf Eis zu legen. Nimm die Eisschale aus dem Gefrierfach, tröpfele ein bisschen Wasser auf das Eis und lege den Block mit der Schnittfläche auf das Eiswasser, so, dass ein bisschen eiakaltes Wasser in die Schnittfläche eindringen kann. Und dann versuche noch einmal, den Block zu schneiden.

Viel Erfolg!

Jürgen

AlexG

Moin Alf,

Wie Florian schon schrieb, würde ich auch von einer zu langen Entwässerung ausgehen.
Bei Material von einer schichtdicke von 1-2mm (Biopsien)benötigt man für eine gute Entwässerung insgesamt 4h, für Schichtdicken von 3-4mm ca 12h.
Auch das zu lange liegen lassen in heißem Paraffin führt zu einer Verhärtung.
Was noch ursächlich ist, jedenfalls in der Alkohol Xylol Methode ... unsaubere Alkohole oder wasserreste im letzten Alkohol vor dem ersten xylol führen unweigerlich zu einer extremen Schrumpfung und Verformung vom Gewebe.
Ich würde dir folgendes empfehlen bei 3-4mm je 1h
50%
70%
80%
90%
100%
100%
Xylol
Xylol
Paraffin
Paraffin

Es gibt auch nette Rezepte im Romeis

Alex

Alf

Vielen Dank für die Antworten und Tipps! Die Gewebe waren definitv viel zu hart, die Leber ist regelrecht zerbröselt beim Schneiden. Werde jetzt mal weniger lange entwässern dann sollte alles funktionieren.

LG,
Alf

güntherdorn

alf,
schau dir mal die paraffin-klebeband-methode weiter unten an:
https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=34507.0
ciao,
güntherdorn
- gerne per du -
günther dorn
http://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=444.0
www.mikroskopie-gruppe-bodensee.de
gildus-d@gmx.de

Alf

Danke für den Hinweis Günther. Meine histologischen Präparate funktionieren bis 2 um problemlos, aber für die botanischen Präparate könnte das eine gute Lösung sein, denn die reißen ziemlich gerne bei mir.

LG,
Alf

Ronald Schulte

Alf,

Aber wenn Sie schon Problemlos bis 2µm schneiden können ist das schon prima denke ich. Da kommt die Untergrenze für Paraffin schon ziemlich im Bild.
Ich wurde mich mal um ein Beitrag mit Bilder freuen!

Gruße Ronald
Mikroskope:
Leitz Orthoplan (DL, AL-Fluoreszenz und Diskussionseinrichtung).
Leica/Wild M715 Stereomikroskop.
Mikrotom:
LKB 2218 Historange Rotationsmikrotom.

Alf

Ronald,

man darf mich gerne mit "du" ansprechen!
Ich arbeite bereits an einem Artikel!  :D

LG,
Alf

ammererlutz

#9
wie kamst du eigentlich auf diese extrem langen Entwässerungszeiten ? Die erwähnten Einbettautomaten arbeiten natürlich sehr schnell, da die Kassetten ständig bewegt werden ( Preis und Reagenzienverbrauch  ist für nicht-Profis natürlich uninteressant, aber bei 200 Proben täglich, was die Patho-Institute so täglich bearbeiten, sind sie ideal, gefärbt wird da natürlich auch nur mehr mit Automaten, außer bei speziellen Fragestellen, wo Immunhistochemische Methoden notwendig werden)

Aber je 24 Std wie du pro Schritt angibst, ergeben ja fast eine Woche !! Romeis ist mit ca 35 Std schon recht großzügig.

Aber da das meiste ja schon gesagt wurde,  hier noch ein Beispiel was z.B noch schief laufen kann:  im Bild sieht man ein unbrauchbares Präparat, ich habe es dann mit Eisspray geschnitten, das ging solala.
Was passierte? : beim Eingießen in die Ausgußform war ich völlig übermüdet ( Mitternacht) und entsprechend unkonzentriet+unbeholfen ( das Eingießen ist bei bestimmten Gewebsproben extrem heikel, da diese in der Achse exakt richtig positioniert werden müssen, und man hat beim erkaltenden Paraffin sehr wenig Zeit) . So passierte es, dass aus Ungeschicklichkeit etwas Wasser aus dem Wasserbad in die Ausgußform schwappte ( wegen der Übermüdung unbemerkt), ich merkte die Katastrophe erst nach dem Aushärten des Blocks....( passiert Instituten nicht, denn dort werden Paraffin-Ausguß Automaten benutzt, die richtige Ausrichtung des Präparates in der Ausgußform ist aber auch dort heikle Handarbeit)
Nochmals Eingießen war zwar möglich, das Präparat aber derart spröde, dass es bei Raumtemperatur nicht mehr schneidbar war.

Nur mal als kleine Anekdote, was so alles passieren kann. ( die Risszeichnung  im Paraffinblock entsteht durch den Kryospray, der leider nötg war, sonst ist so ein Präparat zu entsorgen)
mit freundlichen mikroskopischen Grüßen,
Lutz

"Mikroskope und Fernrohre verwirren eigentlich den reinen Menschensinn" ( Goethe)

Alf

Ich weiß nicht, ich habe mir eingebildet es so gelesen zu haben. Aber ich entwässere jetzt manuell bei 62° im Wärmeschrank (ist natürlich geschützt gegen eventuelle entzündliche Dampf-Luft Gemische) ein. 1 Stunde pro Stufe, auch bei größeren Proben, klappt bestens.