RFB / COL welche Erfahrungen habt ihr?

[purkinje]

Hallo Hubert und René,

genau um diese Effekte ging es mir wenn ich dauernd vom "Abblenden" der äußeren Objektivapertur sprach, auch wenn natürlich etwas mögliche Auflösung des Objektivs flöten geht. Aber um diese Effekte (Grenzdunkelfeld und teils auch den Phasenkontrast) loszuwerden fiel mir nichts anderes ein.

So weit so kurz, die letzte Besprechung zum sanitätstechnische Großkampf naht ("d'Wiesn hoid" wie der Münchner zu sagen pflegt), bis demnächst mal
Beste Grüße Stefan

[3nzo]

Hallo an die Teilnehmer dieser interessanten Diskussion.
Ich blieb auf einer niedrigeren, praktischeren Ebene und versuchte zu überprüfen, ob mit dem normalen Pancraticus und dem Phasenkontrastzubehör der COL des Heine-Kondensors nachgeahmt werden konnte.
Aus diesem Artikel erfahren Sie, wie der Kondensator funktioniert
http://www.microscopy-uk.org.uk/mag/indexmag.html?http://www.microscopy-uk.org.uk/mag/artsep03/pjheine.html
Es scheint, dass der Hauptaspekt der Operation ein Lichtring variabler Größe ist, der an das Objektiv angepasst werden kann (ohne Berücksichtigung der Position ganz oben für das Dunkelfeld).
Ich habe die Fokusvariation des Pankratischen Kondensors genutzt, um die Größe des innersten Lichtrings der Phasenblende zu variieren. Das Objektiv ist ein Planachromat mit Vergrößerung 12,5 und An 0,25 auf einem Knoblauchfilmpräparat.
Das erste Foto ist im Hellfeld und die anderen beiden mit dem COL mit unterschiedlichen Vergrößerungen der Phasenblende.
Mir scheint, dass diese Bilder denen des Heine-Kondensors bei bestimmten Einstellungen durchaus ähneln. Sie sehen
http://www.microscopy-uk.org.uk/mag/indexmag.html?http://www.microscopy-uk.org.uk/mag/artnov03/pjheine2.html.
Indem Sie den Lichtring an den Rand des Objektivfeldes bringen, erhalten Sie auch ein peripheres Dunkelfeld.
Ich hoffe, dass es nützlich sein kann, wenn man die Seltenheit und den hohen Preis des Heine-Kondensators und die Unwirksamkeit der verschiedenen ringförmigen COL-Filter bedenkt, die bei Ebay angeboten werden.
Vielen Dank für die interessante Diskussion und viele Grüße.

Enzo

[Michael K.]

Hallo zusammen,

Meine eigene Konstruktion habe ich quasi immer Einsatz. https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=43844.0
Für jedes Objektiv musste eine eigene Zentralblenden Grösse per Versuch ermittelt werden. Es wurde da auch hinreichend diskutiert. Missen möchte ich das nicht mehr.

Gruss
Michael

[purkinje]

Hallo Michael,
wir hatten uns ja schon einmal über deine "modulierte ringförmige Beleuchtung" (so nenn ich es mal) ausgetauscht, weil ich es für eine interessante Variante halte. Dabei wird die Lichtdurchlässigkeit der Zentralblende variabel. Auf ähnlichem Prinzipen beruhte auch der varibele Phasenkontrast von Pluta und anderen. Da in der mikroskopischen Routine gerne standardisierte und einfach zu reproduzierende Verfahren verwendet werden, konnten sich oft modulierbare Verfahren nicht in der Breite durchsetzen.
Modulierbare Verfahren haben aber, wenn man sich damit tiefer befasst, den Vorteil auf Besonderheiten der Objekte eingehen zu können und auch z.B. den Kontrast weiter optimieren zu können.
Mich würde sehr interessieren wie Du deine Konstruktion angewendet hast um die beiden Bilder von Ceratulina cretacea #135 zu erhalten.

Hallo Hubert und alle interessierten,
zum Thema der möglichen Auflösungssteigerung bei RFB
wollte ich kurz auf den Vortrag von v. Duijn (1) hinweisen wo er die untenstehende Grafik zeigt, welche auf den Werten der Untersuchung zur RFB von T. Y. Kingma Boltjes and C. J. Gorter (2) basiert:



Zusammenfassend kann, wenn man diesen Ausführungen folgen möchte, festgestellt werden, dass die 'Auflösungssteigerung' in dem oben schon genannten Bereich von etwa 20%  liegt. Dies wäre mehr als man zB durch die Verwendung eines immergierten vs trocken verwendeten Kondensors erzielen könnte.

zum Thema von Phasenkontrasteffekten bei der RFB
Bei meinen ursprünglichen Versuchen mit RFB, war ich besonders bei Verwendung von Achromaten ja bestrebt die "randlichen Phasenkontrasteffekte" zu begrenzenen (Aperturblende, was natürlich zugleich die Breite des Lichtrings reduzierte). Die Frage die sich mir aber später stellte, ist ob es sich bei all diesen RFB-Effekten nicht ausschließlich um Phasenkontrasteffekte handelt? Gerade auch in neuerer Literatur erfährt die RFB ja besonders in Zusammenhang mit Quantitativem Phasenkontrast wieder Anwendung (3).
Mich würde hierzu Eure Einschätzung interessieren!

Für alle die sich fragen wie diese hier erwähnten Effekte bildlich auch im Vergleich zu Zernikes Phasenkontrast aussehen gibt es hier von Peter Höbel (#13) ältere aber sehr gute Vergleichsbilder zu sehen; oben RFB (randständig die Objektivapertur beleuchtend 0,85-1R), unten Zernike.

Beste Grüße Stefan

1) C. v. Duijn jr
Ringförmige Beleuchtungssysteme in der Mikroskopie
3. Internat. Mikroskopietage in Hagen 1990
2) T. Y. Kingma Boltjes and C. J. Gorter,
On the influence of the condensor on the resolving power of a microscope.
Proc. kon. Akad. v. Wttensch. 45, S 814ff, (1942)
3) Zuo, C., Sun, J., Li, J. et al. High-resolution transport-of-intensity quantitative phase microscopy with annular illumination. Sci Rep 7, 7654 (2017)

[Michael K.]

Hallo Stefan,
Das erste war Hellfeld, das zweite war mit dunkler Zentralblende, die aber nicht komplett in der Mitte Stand.
Es war eine Sichelförmige Beleuchtung.
Mit der Mikroskopkamera hab ich es direkt invertiert aufgenommen.

Gruss
Michael

[Lupus]

Hallo Stefan,

Zusammenfassend kann, wenn man diesen Ausführungen folgen möchte, festgestellt werden, dass die 'Auflösungssteigerung' in dem oben schon genannten Bereich von etwa 20%  liegt. Dies wäre mehr als man zB durch die Verwendung eines immergierten vs trocken verwendeten Kondensors erzielen könnte.

Ich muss vielleicht zu meiner Aussage dass die RFB im Vergleich zur offenen Aperturblende die Auflösung nicht erhöht ein Missverständnis aufklären: Es ging mir um die physikalische Auflösung. In der Praxis ergibt sich die reale Auflösung natürlich auch durch die unvermeidlichen Mängel bei der visuellen Beobachtung oder fotografischen Aufnahme, nämlich die begrenzte Kontrastauflösung z.B. durch das Sensorrauschen (was ich in dem Zusammenhang schon erwähnt hatte). Bei meinen Vergleichsaufnahmen mit Stauroneis phoenicenteron war es kein Problem die Diatomee auch bei offener Aperturblende gut zu fotografieren weil mit dem Objektiv 40/0.65 die Strukturen noch leicht abzubilden sind und nicht zu eng an der Auflösungsgrenze liegen. Wenn man tatsächlich z.B. eine Diatomee an der Objektiv-Auflösungsgrenze beobachtet muss man bei Hellfeld einen höheren Aufwand treiben um das Rauschen zu unterdrücken und eine mit RFB vergleichbare Aufnahme zu erreichen. Da ist dann auch das Problem dass sich das Objekt mangels Sichtbarkeit gar nicht mehr präzise fokussieren lässt. Insofern ist natürlich die Verwendung von RFB eine brauchbare Lösung solange man sich der möglichen Artefakte bewusst ist.

Hier habe ich aus einem Streupräparat eine Pleurosigma angulatum mit dem selben Objektiv 40/0.65 mit RFB (d/R ≈ 0.5) aufgenommen, mit offener Aperturblende war sie für mich nicht mehr präzise fokussierbar. Einzelbild, keine Nachschärfung, Histogramm etwas gestreckt. Andere störende Objekte im Präparat treten dann natürlich entsprechend auffällig hervor.

Die Frage die sich mir aber später stellte, ist ob es sich bei all diesen RFB-Effekten nicht ausschließlich um Phasenkontrasteffekte handelt? Gerade auch in neuerer Literatur erfährt die RFB ja besonders in Zusammenhang mit Quantitativem Phasenkontrast wieder Anwendung

Mein Eindruck ist dass sich manche Wissenschaftler in diesen Veröffentlichungen nicht ganz über die Problematik bewusst sind, dass bei dickeren Phasenobjekten in der Praxis vollkommen irreguläre Strukturen auftreten können je kohärenter die Beleuchtung ist. Das ist auch der Grund warum eigentlich die mittlerweile unter Biologen und Medizinern so beliebte "Dekonvolution-Software" nur bei Fluoreszenz-Objekten sinnvoll anwendbar ist (wegen deren inkohärenter Lichtabstrahlung). Woran soll man (Zernike) Phasenkontrast ähnliche Objektdarstellungen unterscheiden können, wenn sich feine Diatomeen-Strukturen je nach Fokuslage durch Interferenzeffekte beliebig im ihrem Hell-Dunkel-Kontrast an den Rändern der Objektstrukturen und damit den Phasengrenzen verändern können?

Hubert

[purkinje]

Hallo Hubert,
Du zeigst oben schön was möglich ist; und wer schon einmal mit RFB experimentiert hat, wird sich an genau diesen Bildeindruck von u.U. etwas mehr 'sichtbarer Auflösung' erinnern. Aber natürlich auch in die Tiefe, was Dein Streupräparat gut zeigt, also genau das Gegenteil vom ja durchaus auch geliebten optischen Schnitt.

Mein Eindruck ist dass sich manche Wissenschaftler in diesen Veröffentlichungen nicht ganz über die Problematik bewusst sind, dass bei dickeren Phasenobjekten in der Praxis vollkommen irreguläre Strukturen auftreten können je kohärenter die Beleuchtung ist. Das ist auch der Grund warum eigentlich die mittlerweile unter Biologen und Medizinern so beliebte "Dekonvolution-Software" nur bei Fluoreszenz-Objekten sinnvoll anwendbar ist (wegen deren inkohärenter Lichtabstrahlung).

Es sind halt auch Ingenieure und gelegentlich Physiker von Firmen die der Biomed. Gemeinschaft das Lichtmikroskop mit Zusatz von etwas Filterung und reichlich Software (wieder) verkaufen wollen. Vor allem im Bereich der in vivo Beobachtungen kommen die Fluoreszenzmethoden auch schnell an Grenzen (Ausbleichen und Toxizität der Fluorchrome) und erschweren die erwünschte Quantifizierung.
Aber der von Dir geschilderte unberechenbare "Phasenumschlag" in komplexeren Geweben beim "Quantitativen Phasenkontrast" erschwert dies natürlich ebenso.
Beste Grüße Stefan

[Rene]

Hallo Stefan und Hubert,

Anbei eine Seite aus einem technischen Heft von Cooke, Throughton & Simms, das die Interferenzwerte bei der Objektivherstellung zeigt. Es hat mir verdeutlicht, wie die Pseudophasenkontrastmethode funktioniert, und zwar insbesondere bei den etwas weniger korrigierten Objektiven wie Achromaten statt Apochromaten.

Außerdem hat die Verwendung einer ringförmigen Beleuchtung eine auflösungssteigernde Wirkung. Zumindest scheine ich das aus den Abhandlungen von Osterberg und Wissler zu verstehen. Und das wird der Grund sein, warum der Phasenkontrast trotz der niedrigen NA des Kondensorrings im Vergleich zur NA des Objektivs keine verringerte Auflösung hat. Dies hat zu einem kontinuierlichen Strom von Patenten für andere Belichtungsvarianten geführt. Wir haben das Grayfield-Mikroskop schon einmal gesehen, siehe auch die Arbeit von Piekos und Vodyanoy.
Ich gebe nicht vor, die Mathematik zu verstehen, und leider sehe ich auch keine routinemäßige Anwendung dieser Methoden, sobald ,,echte" Proben anstelle von 2D-Objekten (einschließlich Kieselalgenstrukturen) betrachtet werden müssen.  Stattdessen habe ich jetzt ein Zeiss Sigma SEM in der Ecke stehen

Mit freundlichen Grüßen, René

[purkinje]

Hallo Rene,
ich musste erst mal stöbern was Du mit

Wir haben das Grayfield-Mikroskop schon einmal gesehen, siehe auch die Arbeit von Piekos und Vodyanoy

meinst; ich erinnerte mich dann doch bald an diese "vielversprechenden Ansätze"  ;Hallo Hubert und alle RFB-interessieten,

[EDIT: hier bin ich davon ausgegangen, dass es sich um vergleichbare Konstruktionen handelt, was sich aber so als nicht haltbar herausstellte, s.unten ]
hier noch etwas aus der Literatur zum "Ein-Ring-System":
generell ist ja eine axiale und /oder transversale Auflösungssteigerung das Ziel.
Bei der Konstruktion der Blenden stellt sich ja auch immer die Frage: nur Zentralblende und dann Beleuchtung bis zum Rand der Apertur oder Begrenzung der äußeren Apertur des Lichtrings bevor diese die Apertur des Objektivs erreicht ("randliche Abblendung")

Nun gibt es ein paar Modelle der Optimierung die in der Vergangenheit hierzu bemüht wurden, diese Parameter zu errechnen. Grundlage hierfür sind oft (halbwegs realistische) Grundannahmen zum Gewinn an Auflösung (gain, G) sowie die Annäherung an ein optisch perfektes System (Strehl ratio, S).
Natürlich sind diese Modelle vereinfachend und unterschlagen bestimmte andere Aspekte, aber als grober Anhalt für die Konstruktion von Blenden können sie wohl dienen:
a bzw 𝞺1 bezeichnet den inneren Radius des lichtdurchlässigen Anulus und b bzw 𝞺2 den äußeren Radius (=1 würde also die gesamte Apertur bis zum Rand bedecken). Dunkelgrau bzw. schwarz  sind die untauglichen Regionen, grau die von höherer transversaler und weiß die mit höherer transversialer und axialer Auflösung dargestellt.
Bleiben wir bei oben von Hubert gezeigtem inneren Radius von 0,5r (rot, r= Radius der Objektivapertur), dann sollte bei diesen Modellen der Lichtring außen bei spätestens 0,84r (1/∜2r) begrenzt sein. Auch zeigt sich, dass der innere Radius unter 0,71r (1/√2r) liegen muss um Auflösungssteigerung in 3D zu erlangen.


Canales et al. 2005 Three-dimensional control of the focal light intensity distribution by analytically designed phase masks
Optics Communications 247: 11–18


Zhang 2007 Design of three-dimensional superresolving binary amplitude filters by using the analytical method
Optics Communications 274:37-42

Beste Grüße Stefan

[purkinje]

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[Lupus]

Hallo René,

Anbei eine Seite aus einem technischen Heft von Cooke, Throughton & Simms, das die Interferenzwerte bei der Objektivherstellung zeigt. Es hat mir verdeutlicht, wie die Pseudophasenkontrastmethode funktioniert, und zwar insbesondere bei den etwas weniger korrigierten Objektiven wie Achromaten statt Apochromaten.

man kann mit Programmen die Phasenverschiebung durch konstruktiv bedingte mangelnde Objektiv-Korrektur heute auch berechnen und visuell darstellen. Hier ein Beispiel an einem einfach aufgebauten typischen Achromaten. Diese Phasenverschiebung, die nichts anderes darstellt als eine nicht optimal konstruierte optische Weglänge für den Lichtstrahl durch das Glas im jeweiligen Abstand von der optischen Achse, bewirkt dann die sphärische Längsaberration. Die radiale Verteilung der Phasenverschiebung ist dem gezeigten Beispiel der interferometrischen Messung sehr ähnlich.



Das Problem in der Praxis für Experimente mit Ringblenden für diesen "Pseudo-Phasenkontast" ist, dass diese Form der Phasenverschiebung zwar charakteristisch für einfache Achromate ist, aber bei moderneren Konstruktionen, speziell bei Objektiven höherer NA, auch deutlich davon abweichen kann. Und die Form ist z.T. wellenlängenabhängig. Hier ein Beispiel für den typischen Unterschied zu einem Fluorit, der nicht nur chromatisch sondern auch über die gesamte NA besser korrigiert ist und eine andere Kurvenform der Längsaberration (und damit der Phasenverschiebung) hat:



Hubert

[purkinje]

Hallo René und Hubert,
eure Darstellungen verdeutlichen erneut, wo die Ursachen für die ja so diverse Schilderungen der RFB bzw COL-Effekte liegen.
Dies führte auch bei vielen nach anfänglichen Versuchen, rasch dazu diese Verfahren abzuhaken. Der Grat zwischen den u.U. hilfreichen Phaseneffekten (mehr Kontrast und so auch mehr sichtbarer Auflösung) sowie unberechenbarem Verhalten bei Fokussierung ist schmal. Nach Euren Ausführungen wird mir auch klar weshalb Paul James damals Annuli von etwa 0,65- 0,84r in Verbindung mit (Wild) Fluorit-Objektiven so in seinen Artikeln propagierte.
Beste Grüße Stefan

[Lupus]

Hallo Stefan,

ich habe die von Dir verlinkte Literatur jetzt einmal durchgesehen.

hier noch etwas aus der Literatur zum "Ein-Ring-System"
generell ist ja eine axiale und /oder transversale Auflösungssteigerung das Ziel.
Bei der Konstruktion der Blenden stellt sich ja auch immer die Frage: nur Zentralblende und dann Beleuchtung bis zum Rand der Apertur oder Begrenzung der äußeren Apertur des Lichtrings bevor diese die Apertur des Objektivs erreicht ("randliche Abblendung")

Da dürfte ein Missverständnis vorliegen, Canales u.a. hat ein Dreiblendensystem untersucht (weil nur damit sowohl transversale als auch axiale Veränderungen der PSF vorgenommen werden können), und zwar mit vereinfachten Phasenblenden mit 0 und π Phasenverschiebung.
Mit Bezug auf diese Veröffentlichung hat Zhang die gleiche Methode auf ein Dreiblendensystem mit rein absorbierenden Blenden angewendet mit ebenfalls vereinfachten Pupillenfunktionen 0 und 1. D.h. dass nur die mittlere Zone undurchlässig ist.

Eine nur mittlere Zone durchlässig zu machen macht wenig Sinn, weil man dadurch das Auflösungspotential des Objektivs verschenken würde. Allgemein gilt dass mit nur einer Blende (egal ob zentral oder äußerer Ring) im Vergleich zur nicht abgeblendeten Öffnung die axiale Ausdehnung der PSF sich vergrößert was bei bestimmten Anwendungen von Nachteil ist.

Hubert

[purkinje]

Hallo Hubert,
oh weh, Dank Dir erst mal für die wichtige Korektur, ich sollte nicht von alten Notizen von vor über 10a abkupfern sondern in die Paper gucken; werde es hernach editieren.
Beste Grüße Stefan

[Lupus]

Hallo Stefan,

ein Problem ist dass das Thema schon seit über 100 Jahren in oft nur theoretischen Papieren zu unterschiedlichsten Anwendungen diskutiert wird. Nicht immer sind solche diskutierten Blenden auf Mikroskope übertragbar, z.B. wenn es um Bündelung von Mikrowellenantennen u.ä. geht oder spezielle astronomische Teleskope. Und viele Konzepte sind dann eigentlich nur für Konfokalmikroskopie brauchbar.

Ganz interessant ist diese Veröffentlichung, bei der es um Amplituden-Blenden zur Änderung der axialen PSF geht:
https://www.researchgate.net/publication/243576096_Axial_behavior_of_pupil-plane_filters
Die untersuchten Blenden hatten verschiedene, einfach mathematisch definierte Intensitätsverläufe. Am Ende (Abschnitt 9.) wurden die experimentellen Ergebnisse für zwei Blenden mit kontinuierlichem Transmissionsverlauf gezeigt, eine ringförmige und eine zentrale. Die folgende Abbildung ist zum leichteren Verständnis eine modifizierte Abbildung aus dieser Veröffentlichung. Rechts die drei verglichenen Blendenformen (in der Mitte die nicht abgeblendete Öffnung, die körnige Struktur kommt vom schlechten Scan für die Veröffentlichung). Links in der jeweiligen Reihe die PSF im Fokus (Mitte der Reihe) und außerhalb des Fokus.

Da sind alle typischen Merkmale solcher einfachen Blenden erkennbar im Vergleich zur nicht abgeblendeten Öffnung:
Bei ringförmigen Blenden (oben) hat das zentrale Beugungsscheibchen immer einen etwas geringeren Durchmesser, aber dafür die Beugungsringe wesentlich mehr Intensität. Die zentrale Blende (unten) erzeugt immer ein deutlich breiteres Beugungsscheibchen. Dass die Beugungsringe hier nicht sichtbar sind liegt an dem kontinuierlichen Verlauf der Blendentransmission statt einer scharfen Grenze. Das verringert auch die Beugungsringe der Ringblende mit kontinuierlichem Transmissionsverlauf.
Gleichzeitig reicht die PSF in Achsrichtung bei beiden Blendenformen weiter als bei nicht abgeblendeter Öffnung. Und das ist das allgemeine, bekannte Problem bei Phasenobjekten, wodurch bei dicken Schichten unerwünschte Strukturen außerhalb der Fokusebene kontrastreicher sichtbar werden. 



Hubert