Histologie des Herzens einer Regenbogenforelle (Oncorhynchus mykiss)

[Daniel Scheibenstock]

Hallo Zusammen,

Ich möchte hier meinen ersten histologischen Versuch überhaupt vorstellen – entsprechend war der gesamte Prozess für mich ein praktisches ,,Learning by doing".

Als Ausgangsmaterial diente ein halbes Herz einer Regenbogenforelle. Die Fixierung erfolgte in einem Ethanol/Eisessig-Gemisch, anschließend wurde die Probe für einige Tage in 70 % Ethanol gelagert. Die Überführung in PEG habe ich schrittweise über destilliertes Wasser durchgeführt, bevor die Probe schließlich in reinem PEG 1500 vollständig infiltriert wurde. Der gesamte PEG-Prozess wurde relativ zügig in etwa 2,5 Stunden umgesetzt, was für einen ersten Versuch bewusst pragmatisch gewählt war.

Das Ausgießen des Blocks verlief problemlos, und ich konnte anschließend am Schlittenmikrotom meine ersten Schnitte anfertigen. Geschnitten wurde mit 10 µm unter Verwendung einer Einwegklinge. Allein das Einstellen des Mikrotoms und das Gefühl für den Schnitt waren eine interessante Erfahrung – hier gibt es definitiv noch viel zu lernen.

Die Färbung erfolgte klassisch mit Hämatoxylin. Anschließend wurden die Schnitte mit Wasser gebläut, in Isopropanol gespült und schließlich in Euparal eingedeckt.

Dafür, dass es sich um meinen allerersten Block und meine ersten histologischen Schnitte handelt, bin ich mit dem Ergebnis zufrieden. Es konnten bereits grundlegende Strukturen des Fischherzens erkannt werden, auch wenn natürlich noch Optimierungspotenzial besteht – insbesondere bei der Prozessführung im PEG und der Schnittqualität.

Für mich war dieser Versuch ein spannender Einstieg in die Histologie, und ich freue mich darauf, die Technik weiter zu verfeinern.

Liebe Grüße Daniel


Also Wärme Quelle diente ein Ultraschallbad


Werkzeuge


Fertiges Block in Form


Ich war beim rausnehmen etwas ungeduldig


Das Ergebnis

[Thomas Böder]

Das sieht doch super aus!

[Spectrum]

Hallo Daniel,
Das sieht sehr beeindruckend aus.
Nicht schlecht für den allerersten Versuch.
Ans Schnibbeln (weder histologisch noch botanisch) hab ich mich noch nicht herangetraut.
Dein tolles Ergebniss spornt an.
Beste Grüße Holger

[Daniel Scheibenstock]

Hallo Thomas,

Danke für das Lob☺️

Hallo Holger,

Ich bin recht zufrieden mit dem Ergebnis. Mittlerweile wurde mir zugetragen ich hätte die Färbelösung filtern müssen aber das Ergebnis sei für das Recht schwierige Objekt ziemlich gut😅 ich kann dich nur ermuntern es selbst zu versuchen.

Liebe Grüße Daniel

Ps.: der komplette Prozess ist Grün und verzichtet auf problematische Substanzen!

[Daniel Scheibenstock]

Ich liefere noch ein paar Bilder nach anilin blau


Eosin

[Daniel Scheibenstock]

Methylenblau nach löffler

[Daniel Scheibenstock]

[DieterS.]

Lieber Daniel,

vielen Dank für Deinen Beitrag zur Herstellung von Schnitten durch das Herz einer Forelle!

Zunächst möchte ich Dich gerne fragen, ob Du als Ziel der Präparation einzelne Muskelfaserbündel oder aber die

Gewebestruktur des Herzens im Ganzen darstellen wolltest?


Die Frage stellt sich, weil Du die Herzstücke mit einem Gemisch aus Essigsäure und Alkohol behandelt hast. Ein

derartiges Gemisch ist eigentlich keine Fixierung, sondern eher eine Form der Konservierung, bei dem der Essig-

säureanteil quellend und der alkoholische Anteil entwässernd aber auch schrumpfend wirkt. Das entsprechende Verhältnis

beider Anteile muss objektabhängig aufeinander abgestimmt sein, um eine optimale Darstellung des Replikes des Ur-

sprungsgewebes zu erhalten. Bei einer Fixierung werden die zellulären Strukturen und Organellen mit einem Fixans, im

zoologisch-histologischem Bereich in der Regel Formalin oder Glutardialdehyd, vernetzt, so dass ihre Raumanordnungen

festgelegt sind und sich auch bei einer anschließenden alkoholischen Entwässerung weitgehend erhalten. Neben dem

strukturellen Erhalt ist die Wahl des richtigen Fixans bzw. eine sachgemäße Fixierung auch entscheident für das

histologische Färbeverhalten. Nicht fixierte oder fehlerhaft fixierte Gewebe zeigen häufig ein atypisches Färbebild,

dass z.B. an Schittkanten auftritt, bei denen Sauerstoffkontakt zu lytischen Veränderungen an den Gewebekanten geführt

hat. Bei einer Fixierung ist zu empfehlen, das Fixans vor einer Einlage des Gewebes auf ca. 4 Grad Celsius runter zu

kühlen um eine Lyse zu vermeiden bzw. zu verringern. Dies gilt besonders für Organe, die einen retikulären Aufbau

(Organe des Fisches, Milz der Maus, usw.) besitzen. Zum Beispiel sollte bei einer Präparation einer Maus die Milz als

erstes entnommen werden. Fazit hier: Solltest Du dich für die zoologische Histologie entscheiden, wirst Du an Formalin

nicht vorbei kommen.

Ging es Dir in Deiner Arbeit aber um eine alleinige Darstellung der Muskelfaserbündel, kann man so vorgehen, wie Du es

getan hast: Die Essigsäure wirkt hierbei quellend und leicht mazerierend, so dass die Muskelfaserbündel aus ihrem Ge-

webeverband gelöst und dabei anschwellen. Diese Eigenschaft wird u.a. auch zur Darstellung von Chromosomen genutzt.

Dabei geht aber das Gesamtbild des Gewebes mit den Raumlagen verloren, dass aus Muskelfaserbündeln, Blutgefäßen,

Fettzellen, usw. bestehen kann. Beim Herzmuskel, ein Sonderfall der quergestreiften Muskulatur, ist vor allem

für den Anfänger die Gesamtarchitetur schwer zu erkennen, da die Verlaufsrichtungen der Muskelfasern wechseln

und nicht geordnet erscheinen, anders verhält es sich bei einem Schnitt durch einen quergestreiften Skelett-

muskel.

Du beschreibst, dass Du Stücke des Forellenherzmuskels in Polyethylenglykol eingebettet hast. Polyethylenglykol

besitzt in Abhängigkeit von der molekularen Masse eine unterschiedliche Wasserlöslichkeit aber auch ein

unterschiedliches Quellungsverhalten. Diese Verhaltenweisen von Schrumpfung (thermoplastisches Verhalten beim

Erstarren) und Quellung wirkt auf das einzuschließende Gewebe ein. Bei einer fehlenden Fixierung (Vernetzung) treibt

die Quellung die Gewebeanteil auseinander. Aus diesem Grunde sind PEG-Einbettungen nur für Strukturen geeignet, die

eine feste, inneren Gewebestruktur besitzen, wie z.B. Sprosse von Pflanzen. Für die meisten zoologischen Gewebe sind

PEG-Einbettungen nicht geeignet (als Ausnahme sei hier die Gefrierschnittechnik benannt). Aber auch hier gibt es

Ausnahmen:

PEG-Einbettungen sind das Mittel der Wahl wenn z.B. entkalkte Hartgewebe wie Knochen, Knorpel, Sehnen oder

Zähne geschnitten werden müssen. Wichtig ist hierbei, dass bei Verwendung von EDTA als Entkalkungsmittel, das Salz/das

Kristallisat vollständig aus dem Hartgewebe ausgewaschen wird, da ansonsten eine "Rückkristallisation" von EDTA im

Gewebe droht, die zu ähnlicher Schnitthärte führen kann, wie die zuvor vorhandenen natürliche Inkrustierung

mit Calciumhydroxylapatit. Da im Verbund PEG-Hartgewebe, Wasser enthalten ist, liegen die entkalkten Hartgewebe vor

dem Schnitt in einem hydratisiertem, leicht gequollenem Zustand vor und sind so z.B. mit D-Messern schneidbar, ein

Zustand, der weder durch eine Paraffin- noch durch eine Kunststoffeinbettung erreicht werden kann.

Ein weiterer Nachteil der PEG-Einbettung besteht darin, dass die Schnitt sich nur schwer auf Objektträger aufziehen

lassen, dabei häufig zerfallen und in der Regel nicht klebbar sind. Bei einer anschließenden Wässerung und Färbung der

Schnitte auf Objektträgern schwimmen sie ab und sind somit nicht einschließbar.

Nun noch ein Wort zum Laborgerät: Mit einem heizbarem Ultraschalbad einzubetten ist sicher keine gute Idee, da die

Ultraschallgeräte, auch wenn heizbar, nicht für einen Langzeitbetrieb ausgelegt sind. Ich würde immer empfehlen, ein

Blockheizgerät mit Einsätzen zu verwenden. Diese Geräte werden häufig zu günstigen Preisen gebraucht angeboten und

haben den Vorteil, das Glasgefäße unterschiedlicher Größen (verschraubbare Reagenzgläser im Milliliterbereich bis

Apothekengläser bis 50 ml) eingestellt werden können, Paraffin sich darin aufschmelzen lässt und temperaturkonstant

gelagert werden kann. Ein Paraffinwechsel ist unproblematisch. Die Objekte können entnommen und eingebettet werden.

Die Paraffin-Gebrauchsansätze werden dekantiert und die Gebinde mit neuen Paraffinpellets gefüllt. Auf diese Weise

sammeln sich keine paraffinverschmutzten Gläser im Labor, die nur schwer und unter Lösungsmitteleinsatz gereinigt

werden können. Zudem wirken überstehende Röhrchen- oder Glashälse als Paraffinfalle, so dass keine

Paraffindämpfe in das Labor austreten können. Abraten möchte ich Dir in jedem Fall vom Gebrauch von Wärmeschränken zur

Paraffineinbettung. Diese sind bereits nach kurzem Gebrauch ,,versaut" und lassen sich nicht mehr vollständg

reinigen!

Als Fazit bleibt, zu sagen: Solltest Du dich für die zoologische Histologie entscheiden, führt kein Wege an einer

Formalinfixierung und einer Paraffineinbettung vorbei. Ich vermute, dass Deine Präparation sich stark an der

botanischen Histologie orientiert hat. Bei einer Entscheidung für die zoologische Histologie muss in verschiedener

Weise investiert werden (Zeit, Geld, Arbeitsplatz, Chemikalien, usw.). Dass das auch mit geringem Aufwand möglich

ist, ist im Forum schon mehrfach bewiesen worden!

Ich wünsche Dir weiterhin viel Erfolg und bin gespannt für was Du dich auf Dauer entscheiden wirst.

Herzliche Grüße!

Dieter

[Daniel Scheibenstock]

Guten Morgen lieber Dieter,

vielen Dank für deine ausführliche Antwort auf meinen Beitrag 🙂
Ich fühle mich wirklich geehrt, dass du dir die Zeit nimmst, einem absoluten Anfänger wie mir so fundiert weiterzuhelfen und dein Wissen so offen zu teilen.

Zum Thema Formalin habe ich dir eine PN geschickt.

Ergänzend dazu: Ich finde es auch spannend zu sehen, wie stark sich eher problematische Stoffe in solchen Prozessen reduzieren lassen. Prinzipiell hätte ich bei dieser Fixierung auch über Paraffin gehen können, allerdings hätte das den Einsatz von Xylol erfordert – und damit wäre der gesundheitliche Vorteil für mich dahin gewesen. Insofern war dieser Ansatz für mich die bessere Wahl. Du hast aber völlig recht: Das Vorgehen ist stark an die botanische Technik angelehnt. Die Zeiten beim Einbetten müssen jedoch deutlich verkürzt werden, sonst ist das Gewebe am Ende eher ,,gar" 🥳

Mein Ultraschallbad hat sich dabei als recht gut geeignet erwiesen. Die Temperatur ist einstellbar (und von mir auch überprüft worden), und die Ultraschallfunktion lässt sich deaktivieren – was ich in diesem Fall auch getan habe. Einen Wärmeblock hätte ich ebenfalls zur Verfügung, allerdings nur für kleine Rundküvetten. Eine bessere Alternative habe ich bisher noch nicht gefunden, aber ich bleibe dran 🙂

Wohin die Reise geht, weiß ich ehrlich gesagt noch nicht genau. Im Moment probiere ich einfach vieles aus – aus Neugier, Forscherdrang und auch ein wenig aus Langeweile. Das Herz der Forelle (und andere Gewebe) eignet sich für mich gut, da ich als Fischer selbst Zugriff darauf habe und die Proben die nötige Frische mitbringen. (Das Tier selbst hat übrigens hervorragend geschmeckt 🥳) Es werden sicher noch weitere Versuche und auch andere Verfahren folgen.

Auf jeden Fall bin ich sehr froh, dich im Forum zu haben. Es ist wirklich wertvoll, wieder jemanden mit so viel Expertise dabei zu wissen – das hilft uns ,,Bastlern" ungemein weiter. Nochmals vielen Dank für die vielen Anregungen ☺️

Liebe Grüße
Daniel

[Daniel Scheibenstock]

Ergänzend eine Frage:

was ist zu bevorzugen, Laborwasserbad oder Dryblockheater?

Wärmeplatten hätte ich sogar 2 da, da müsste ich ja nur aluheizbklöcke bauen/kaufen☺️

Zu der Frage was ich zeigen wollte: Ich habe erst nach dem schneiden in mein Histologiebuch geschaut. Und mein Ergebnis mit dem verglichen. Auch sieht man an der Hämatoxylin Färbung das ich zum bsp das Filtern vergessen habe und das m.E auch überfärbt ist.... Wie schon erwähnt das ist alles mal nur der erste Versuch🙈

Liebe Grüße Daniel

[DieterS.]

Lieber Daniel,

ein Wasserbad ist beim Arbeiten mit Polyethylenglykol ungeeignet, da Polyethylenglykol hygroskopisch, was

bedeutet, dass es Wasser aus der Dampfphase Deines Bades bindet.

Mit Bastelprojekten wäre ich vorsichtig. Eine solche Wärmequelle muss langzeitlich unbeaufsichtigt arbeiten

können. Diese Voraussetzung ist bei einem soliden Heizblockthermostat gegeben; ein Brand im Labor wäre sicher

eine Katastrophe.

Viele Grüße!

Dieter

[Daniel Scheibenstock]

Lieber Dieter,

Das Labor ist wie alle Zimmer mit Brandmelder ausgestattet. Dennoch verzichte ich gerne auf einen Brand🤪. Die Heizplatten die ich habe sind Laborgeräte die die Hitze von unten abgeben. Das halte ich für suboptimal daher Die Idee der Alukörper um die Hitze gleichmäßiger in die Probeflaschen zu bringen. Eventuell kann mir jemand einen Link zu einem ordentlichen Gerät senden, oder ein Foto seines damit besser verstehe wie die aufgebaut sind. Das das ich verwende für die Küvetten ist für den Aufschluss in der chemischen Analyse (Photometrie!)

Die Ausgeführte PEG Einbettung war in verschlossenen Kunstoffprobebehältern.

Liebe Grüße Daniel

[jcs]

Das halte ich für suboptimal daher Die Idee der Alukörper um die Hitze gleichmäßiger in die Probeflaschen zu bringen. Eventuell kann mir jemand einen Link zu einem ordentlichen Gerät senden, oder ein Foto seines damit besser verstehe wie die aufgebaut sind.

Hallo Daniel,
die von Dieter angesprochenen Blockthermostate finde ich auch sehr praktisch. Einerseits kann man sie problemlos unbeaufsichtigt "schmurgeln" lassen. Andererseits kann man mit vergleichsweise kleinen Probengefäßen (Rollrandgläser) arbeiten und so mit Kleinmengen an Chemikalien auskommen. Die Einsätze haben bei den meisten Herstellern identische Abmessungen, soviel ich weiß.

Ich habe für die Rollrandgläser einen kommerziellen Einsatz in Verwendung. Für das Aufschmelzen bzw. Warmhalten von Paraffin im kleinen Becherglas habe ich mir einen Einsatz fräsen lassen, siehe Bild unten. Das hat sich bis jetzt gut bewährt.

Man kann den Einsatz natürlich auch auf eine Heizplatte stellen, mit ein paar Kompromissen bei der Temperaturkonstanz innerhalb des Blockes.

LG
Jürgen

[hebi19]

Hallo Daniel und Mitleser/Mitdenker

Ich schreibe als jemand, der seit vielen Jahren sich theoretisch mit dem Einstieg in die zoologische Histologie befasst aber noch nichts in die Praxis umgesetzt hat.

Zum Thema Notwendigkeit von Aldehyden bei der Fixierung hat Dieter ja schon einiges geschrieben. Ich persönlich halte bei den klassischen Fixiermitteln das Formalin noch für ziemlich unproblematisch bei den Mengen, die man als Hobbymikroskopiker verwendet. Ich habe einen kleinen Vorrat an Paraformaldehyd. Damit lassen sich nach Bedarf kleinste Mengen "aktives Formalin" herstellen. Es gibt hier im Forum ja eine ausführliche Stellungnahme von Florian Stellmacher - also aus berufener Feder - zu seiner Meinung über den Einsatz von Formalin im Hobbybereich.
Bei den erwähnten klassischen Fixierungen wird ja noch mit Sublimat, Kaliumdichromat, Pikrinsäure, Osmium u.a. gearbeitet. Das ist für den Wohnungsbereich wohl tatsächlich nicht geeignet.....
Ich bin aktuell bei der Recherche zu Zink-Formalin als Ersatz für die Bouin-Fixierlösung mit Pikrinsäure. Verwendet wird Zinksulfat....also auch ein Bestandteil von Blumendünger und damit im Heimbereich wohl unproblematisch.

Aber jetzt nochmal zu deiner Aussage zur Notwendigkeit von Xylol bei Paraffin-Einbettung. Heinz Streble und Annegret Bäuerle beschreiben in ihrem Farbatlas "Histologie der Tiere" die Verwendung von Butanol als Intermedium. Zitat:  "Butanol ist ein hervorragendes Intermedium und ersetzt Xylol, Toluol u.ä. komplett."
Außerdem schreiben sie: "..In eiligen Fällen kann Butanol selbst auch entfallen, da sich Propanol und flüssiges Paraffin mischen." Also geht es sogar auch nur mit Propanol als Zwischenmedium.

Somit ist in meiner Sicht eine Angst vor einer Paraffineinbettung im Heimbereich eigentlich nicht so richtig begründet....und ich hoffe in der nächsten Zeit meine ersten eigenen Proben in Paraffin einzubetten.

[jcs]

Aber jetzt nochmal zu deiner Aussage zur Notwendigkeit von Xylol bei Paraffin-Einbettung. Heinz Streble und Annegret Bäuerle beschreiben in ihrem Farbatlas "Histologie der Tiere" die Verwendung von Butanol als Intermedium. Zitat:  "Butanol ist ein hervorragendes Intermedium und ersetzt Xylol, Toluol u.ä. komplett."
Außerdem schreiben sie: "..In eiligen Fällen kann Butanol selbst auch entfallen, da sich Propanol und flüssiges Paraffin mischen." Also geht es sogar auch nur mit Propanol als Zwischenmedium.

Bob hat hier im Forum öfters Ergebnisse mit Isopropanol/Paraffin gezeigt:
https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=35948.0

Man muss allerdings bedenken, dass sich Paraffin in Isopropanol nur bei erhöhter Temperatur (>40°C) löst. Wenn man nicht mit abgedichteten Gefäßen arbeitet, hat man überall einen Paraffinfilm auf den Geräten, da das verdampfende Iso Paraffin mitschleppt. Xylol wird man dennoch benötigen, wenn die Schnitte auf dem Objektträger von Paraffin befreit werden, bevor es ans Färben geht.

Wer also kein Xylol verwenden will, sollte eher an Ersatzmedien auf Basis von Limonen denken (Rotihistol).

Solange man halbwegs umsichtig arbeitet und die Arbeiten mit Handschuhen in einem gut belüfteten Raum durchführt, sehe ich keine wirklichen Probleme bei Paraffintechniken (Intermedien, Xylol, Rotihistol, ..). Mit zoologischen Schnitten habe ich allerdings nie gearbeitet, ich bin auf der Botanikseite gelandet, siehe z.B. (https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=51424.0)


LG
Jürgen