Standardpräparate Kontrastverfahren

[Jürgen Boschert]

Hallo zusammen,

habe heute Abend den ersten Teil meiner Suche nach Standardpräparaten für DIC und ggf. andere Kontrastverfahren im Unterboard Mikro-Know-How / Technik eingestellt.

Über Rückmeldungen gute wie kritische freue ich mich wie immer.

EDIT durch Moderation: Hier das PDF zu den o.ä. "Standardpräparaten":

https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?action=dlattach;attach=50248

[Daniel Scheibenstock]

Hallo Jürgen,

Mein Standartpräparat sind die Ephitelzellen.

Warum?

Immer dabei!
Mit Bakterien!
Einfache Präparation!


Schönen Abend,

Daniel

[Jürgen Boschert]

Hallo Daniel,

ich hatte geschrieben in dem PDF, warum das für mein Vorhaben nicht geht.

[Daniel Scheibenstock]

Ok, habs gelesen und verstanden. 🙈

Hmm, das macht die Sache doch verzwickter. Ich würde mal Insektenflügel probieren, ungefärbte   Dünnschnitte von Pflanzen, Pollenpräparate oder queerschnitte von Haaren. Aber ehrlich gesagt keine Ahnung was am besten ist🙈

[purkinje]

Hallo Jürgen,

ein interessanter Ansatz diese Glaskügelchen, sie zeigen ähnlich  wie Luftblasen schön die Interferenzstreifen direkt im Präparat.
Da ich aber nicht erkennen kann, wie hiermit etwa

• Amplituden oder evtl besser Kantenkontrast
• Reliefeffekt, also der Phasenkontrast des DIK
• Optische Schnitte, bei höheren Vergrößerungen

gut beurteilt werden könnten, finde ich die Kügelchen als zusätzliche Ergänzung interessant, allein würde ich sie jetzt nicht verwenden.

Hubert hatte bei seiner Abhandlung z. schiefen Beleuchtung, Bild 21 schon einmal Geschmacksknospen gezeigt, Michael hatte Mundschleimhautepithelien in Glyceringelantine verwendet.
Ich vermute und befürchte mal das eine geeignetste Präparat wird sich nicht finden lassen. Vor allem nicht über die ganze Bandbreite der Vergrößerungen.
Selbst in einem der klassischen Paper zum DIK, werden die verschiedensten Präparate von Diatomeen, über befruchtete Pflanzensamen, Hinnervenkerne, Drosophila-Chromosomen und Rädertier verwendet:
R D Allen, G B David, G Nomarski; The Zeiss-Nomarski differential interference equipment for transmitted-light microscopy; Z Wiss Mikrosk 1969 Nov;69(4):193-221.

Beste Grüße Stefan
 

[A. Büschlen]

Hallo Jürgen,

danke, dass du deine "Suche nach Standardpräparaten für DIC und ggf. andere Kontrastverfahren" mit uns teilst.

Ich verwende gerne ein Präparat mit Flügelschuppen von Maniola jurtina L. eingedeckt in Entellan; Zwiebelhäutchen Eindeckmittel nicht angeschrieben und Diatomeenpräparate.

Aus meiner Sicht ist die Herausforderung in der Praxis der Amateure ein geeignetes, reproduzierbares Objekt zur Hand zu haben das in einer minimalen, sprich optimalen Schichtdicke eingedeckt ist.
Dies gilt aus meiner Sicht für DIC und Phasenkontrast.

Grüsse Arnold

[rlu]

Hallo Jürgen,

was wäre denn theoretisch ein perfektes Prüfpräparat?

Ich habe keinen Dic zu Hause. Aber es scheint ja so, dass der Dic die geometrische Realität nicht immer genau abbildet und anfällig für höhere Schichtdicken ist.

Also müßte man mit bekannten geometrischen Strukturen(Kugel ist schon mal gut) arbeiten und diese dann zusätzlich mit Varianten aufdoppeln/unterlegen. Vielleicht kann man sogar organische und anorganische Strukturen mischen.

Da der Strahl ja durch das Prisma geteilt wird, und materialabhängig ist, wäre es noch sinnvoll mit verschiedenen Materialen zu arbeiten.



Liebe Grüße
Rudolf

[Lupus]

Hallo,

an dem Beispiel des optischen Schnitts in Glashohlkugeln sieht man schon einmal einen Teilaspekt der unterschiedlichen Abbildungsqualität verschiedener Kontrastverfahren. Ich habe aus Jürgens Aufnahmen das zentrale Objekt für Phasenkontrast (links), schiefe Beleuchtung (Mitte) und DIK (rechts) herausvergrößert (und etwas im Bildkontrast modifiziert).

Dass Phasenkontrast für dicke Objekte nicht gut geeignet ist, ist ja bekannt. Bei diesem Beispiel fällt das allerdings weniger auf da praktisch keine Phasenstrukturen, oder zumindest keine strukturierten, außerhalb der Schärfenebene des Objektivs allzu störend interferieren. Allerdings ist der Haloeffekt natürlich ausgeprägt.

Dagegen finde ich die schiefe Beleuchtung relativ gut und objektgetreu, vor allen Dingen wenn man weiß dass sie Phasensprünge systematisch durch helle oder dunkle Übergänge quer zur Symmetrieachse zeigt. Das gilt für die äußeren Ränder der Glashohlkugel, weil dort der Phasensprung zwischen Glas und Eindeckmedium relativ gering ist (im Gegensatz zum inneren Übergang zu Luft, für den eigentlich kein Phasenkontrastverfahren erforderlich wäre). Eigentlich wird nach diesen Grundsätzen die Hohlkugel sehr gut interpretierbar dargestellt.

Beim DIK ist doch der Halo im Vergleich zur schiefen Beleuchtung, die ja auch ein differentielles Phasenkontrastverfahren ist, eher unschön stark ausgeprägt. Mich wundert etwas dass hier der Reliefeffekt überhaupt nicht vorhanden ist. Und auch der innere Hohlkugelrand wird durch stärkere, zu diesem parallel verlaufende Artefakte gestört (das 2. DIK-Bild hatte den Halo nicht, war mir aber hier zur Demonstration etwas zu Dunkel).

Wenn man das Preis-Leistungsverhältnis der Verfahren betrachtet, hat hier m.E. die schiefe Beleuchtung gewonnen. 



Hubert

[M59]

Hallo,

Jürgen herzlichen Dank für Deinen sehr interessanten Beitrag!

Ganz nach Herrn Preisler: "Wichtig ist auf'm Platz!" sind für mich als Praktiker biologische Präparate zur Beurteilung der DIK Eignung intutiv besser geeignet.
Für eigene Tests habe ich zwei ungefärbte histologische Dünnschnitte von 4 bzw 8 Mikrometern Stärke als Referenzobjekte verwendet.

Ein anderes gut geeignetes Präparat,  welches jeder Nutzer ohne Gefahr von Schleimhautläsionen im Mund immer wieder herstellen kann,  sind Proben von Schimmelpilzen, -'Gewebe', -Hyphen bzw. Sporen die im Präparat in unterschiedlicher Dicke vorliegen.
Die Möglichkeit optischer Schnitte/Reliefbildung im DIK lässt sich aus meiner Sicht sehr gut testen und im Hellfeld, Phasenkontrast, Df, usw. vergleichen.
Ein weiteres wichtiges Kriterium ist für mich die Stärke des Helligkeitsgradienten im Bild. Objektive bei denen mit dem 'neuen'  Zeiss Schieber' DIK ein deutlicher Gradient nicht vermieden werden konnte, habe ich als wenig geeignet eingestuft.

Grüße,

Michael/M59

[purkinje]

Hallo Jürgen,
ich Rätsele etwas; wir sehen ja durch die "Hohlkugellinse", quasi wie ein Hilfsmikroskop auf Präparateebene, auf das Streifenfeld des unteren, kondensorseitigen Prismas. Gibt es unterhalb des Präparates irgendetwas Doppelbrechendes, war da noch ein Verzögerer? Ich frage weil ein Verstellen des Polarisators allein, nicht das seitliche ( n. N-O) auswandern der Streifen, sondern ein "Verblassen" bewirken würde


Bei Verwendung der 𝞴-Platte zeigt sich ja, wie erwartet, ein weiteres Wandern der Streifen, jedoch ist der Hintergrund senfgelb und nicht rot, was auch für zusätzlich Verzögerndes spricht:

Beste Grüße Stefan

[Peter V.]

Hallo,

die Effekte der Glaskügelchen sind zweifellos interessant, allerdings für mich doch etwas abstrakt. Für den Physiker und den primär an theoretischen Effekten Interessierten mögen sie durchaus Aussagen liefern, allerdings reicht meine Phanatasie oder Interpretationsfähigkeit nicht aus, hieraus Rückschlüsse auf die Qualität eines DICs oder sonstiger Kontrastverfahrens zu ziehen.

Die Frage an Jürgen Boschert lautet auch, w a s genau Du an dem von Dir gewünschen "Standardobjekt" beurteilen können möchtest. Kontrast? Auflösung? Qualität des optischen Schnittes?

Sehe ich es richtig, dass die Mundschleimhautzellen grundsätzlich schon das ideale Objekt dazu wären, wenn es nur eine Möglichkeit gäbe, diese so zu fixieren und einzudecken, dass sie keinen Veränderungen durch weitere Austrockung etc. unterliegen?

Herzliche Grüße
Peter

[Florian D.]

Ich bin gespannt auf die Vollkugeln in Einbettmedium. Die Dicke der Hohlkugelnzusammen mit dem hohen Brechungsindexunterschied zwischen Luft und Einbettmedium/ Glas scheint mir zuviel zu sein.
Warum machst Du einen extra Thread auf, aus dem man nicht direkt auf Dein Dokument zugreifen kann? Wenigstens ein Link wäre nicht schlecht, dass man das nicht mühsam suchen muss.

Viele Grüsse
Florian

[Peter V.]

Hallo Florian,

in habe den Link zum PDF über die "Standardpräparate" noch einmal Jürgens Eingangsposting in diesem Thread als EDIT hinzugefügt.

Herzliche Grüße
Peter

[Lupus]

Hallo Florian,

Die Dicke der Hohlkugelnzusammen mit dem hohen Brechungsindexunterschied zwischen Luft und Einbettmedium/ Glas scheint mir zuviel zu sein.

natürlich ist die gesamte Dicke der Kugeln zu groß für jede Art Phasenkontrastverfahren. Aber der innere Teil, wo Glas an Luft angrenzt ist auch weniger der interessante Aspekt, sondern der äußere Übergang zwischen Glas und Eindeckmedium. Wenn diese Brechungsindizes genau übereinstimmen würden, dann wäre der äußere Kugelrand praktisch unsichtbar, auch für Phasenkontrastverfahren. Aber natürlich haben übliche Eindeckmedien einen mehr oder weniger abweichenden Brechungsindex, und der reicht dann bei etwas dickeren Objektstrukturen wie z.B. das am Kugelrand angeschnittene Segment innerhalb der Auflösungsgrenze des Objektivs aus, um einen starken (eventuell zu starken) Phasensprung zu erzeugen.

Ich habe mit Glasfasern, eingebettet mit Immersionsöl, experimentiert. Die waren im Hellfeld mit geöffneter Blende absolut unsichtbar. Erst z.B. mit schiefer Beleuchtung erschienen sie mit relativ weichem Kontrast am Rand, jedenfalls nicht als rein schwarz-weiße Kante.

Hubert

[Jürgen Boschert]

Hallo zusammen,

erst einmal möchte ich mich dafür entschuldigen, dass ich meinen Technikbeitrag hier nicht verlinkt hatte. In diesem Zusammenhang herzlichen Dank an Peter V., dass er das für mich nachgeholt hat.
Über die doch rege Resonanz freue ich mich wirklich.

Es kam die Frage auf, was nach meiner Auffassung ein ideales Standardpräparat sei. Meine Idee war, eine schlichte Objektform zu haben, an der man die Effekte der verschiedenen Kontrastverfahren nachvollziehen, evtl. sogar vermessen kann. Damit sollte auch eine reproduzierbare Vergleichbarkeit erreicht werden. Entsprechende, evtl. mögliche Berechnungen werde ich selbst nicht anstellen können, da mir persönlich hierfür der physikalisch-mathematische Hintergrund fehlt; aber vielleicht wird ja in dieser Richtung ein anderer in diesem Forum dann weitermachen können.
Das Schleimhautpräparat ist nicht unbedingt in diesem Sinne ideal, aber es hat unbestreitbare Vorteile: Es ist ein weit und hinlänglich bekanntes Objekt, für das die meisten von uns auch ein gewisses" intuitives Gefühl" entwickelt haben; es ist leicht und jederzeit herstellbar und weist sowohl große wie auch sehr feine Strukturen auf. Reproduzierbarkeit im strengen Sinne ist damit nicht zu erzielen. Da sich die Verhältnisse im Präparat über die Zeit ändern, ist es auch für längere Untersuchungen nicht ohne weiteres geeignet.
Ursprünglich hatte ich die Idee eine Suspension von Eindeckharz und einer darin nicht löslichen Flüssigkeit mit anderem Brechungsindex (z.B. Wasser) heranzuziehen, das erschien mir aber nicht so einfach, insbesondere was eine reproduzierbare Größe der Einschlüsse anbelangt; werde es demnächst einfach mal testen.
So kam ich letztlich auf die Glaskugeln.

Was hoffe ich damit beurteilen zu können: 1. Zunächst die Objekttreue der Abbildung.
2. Dann aber auch die Qualität und das Ausmaß der Kontrastierung; dazu sollte der Brechungsunterschied zwischen Objekt und Eindeckmedium gering sein; das ist ja bei den Hohlkugeln nicht der Fall, wohl aber bei den Vollglaskugeln, wie wir noch sehen werden. Man kann das natürlich noch präzisieren, wenn man Glas genau definierter Brechkraft verwendet und mit dem Eindeckmedium quasi optisch titriert (da wird's dann aber technisch professionell).
3. Erkennen sollte man auch die Separierung verschiedener Ebenen in der Z-Achse, d.h., inwieweit Objekte ober- und unterhalb der Fokusebene sich störend überlagern. Im Idealfall sind optische Schnitte möglich.
4. Spezielle Effekte eines Kontrastverfahrens wie beispielsweise der Pseudo-3D-Effekt sollte erkennbar, evtl. sogar quantifizierbar sein.

Nun noch speziell zu purkinjes Beitrag (#9) in diesem Faden:

Nein, da ist nichts weiter doppelbrechendes im Strahlengang. An Polarisator- und Analysatorstellung habe ich nichts verändert, sondern das Hauptprisma in der Horizontalen verschoben; dabei war mir eben aufgefallen, dass der Interferenzstreifen 0. Ordnung bei maximaler Dunkelstellung des Hintergrundes exakt mittig in der Kugel lag. Dass in der Luft in den Hohlkugeln die Interferenzstreifen sichtbar sind, liegt sicher daran, dass hier eine zusätzliche Linse in das System eingebracht, in diesem Areal die Objektivbrennweite verändert wurde und damit innerhalb der Hohlkugel die Bedingungen für einen homogenen Hintergrund nicht mehr gegeben waren.
Im Farbkontrast -dieser wird durch Einschieben einer Lambdaplatte erzielt- ändert sich die Hintergrundfarbe ebenfalls mit der lateralen Position des Hauptprismas; mir hat da halt Senfgelb besser gefallen als die anderen Farben.