Normalesmikroskop mit fluoreszenz ausstatten?

[Klaus Herrmann]

Hallo Rolf,

Wenn das nicht der Fall ist, muss einer von uns zum Augenarzt!

ob der uns hierbei hilft? Ich bin fehlsichtig, aber durchaus farbtüchtig!

In meiner Argumentation beziehe ich mich auf das 2. Bild, auf dem man unschwer rote Algenfäden sieht, die auf einer deutlich grünen Alge sitzen.
Da vermute ich stark, dass die grüne Farbe von Chloroplasten kommt, die wiederum Chlorophyll enthalten.
Nun wird diese Bild herangezogen als Beleg dafür, dass die Methode mit Polarisation im DL in Kombination mit DF zur Fluoreszenzanregung des Chlorophylls geeignet ist.

Nehmen wir mal an das geht tatsächlich - ich bezweifle das - dann ist dieses Bild als Beleg nicht geeignet, weil da die "Methode" eindeutig versagt!

Oder leuchtet das Chlorophyll auf diesem Bild für Dich tiefrot, wie man das erwarten sollte?

Bei den roten Fäden auf dem selben Bild habe ich keine Ahnung, wie sie im normalen HF oder DF aussehen. Man könnte auch das für Polarisation Naheliegende annehmen: es ist eine doppelbrechende Matrix, die durch geeignete Schichtdicke eben gerade die Interferenzfarbe rot ergibt.
Das könnte man überprüfen durch Zuschalten eines Kompensators.

Und nun warte ich auf schöne Zieralgen die durch Polarisation rot fluoreszieren! Bitte Feuer frei! Das gibt einen schönen Artikel im Mikrokosmos für das Aprilheft!

Als Vorgriff auf diesen Aprilartikel biete ich hier schon mal ein Bild mit polychromatischer Fluoreszenz durch Polarisation:    

[Bernhard Lebeda]

Verehrte Freunde

seltsamerweise fiel die allgemeine Reaktion vor zweieinhalb Jahren wesentlich positiver aus:

http://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=396.0

Ich persönlich hatte das ja als genial abgespeichert. Die Diskussion liess keinen anderen Schluss zu. Sollte ich da was revidieren müssen??


Viele autofluoreszierende Grüsse (Farbe Ihrer Wahl  )

Bernhard

[Detlef Kramer]

Ja und,

was habe ich damals geschrieben?

Dir Bernhard vielen Dank, vor allem für Dein gutes Gedächtnis und Deine gute Buchführung!

Also meine aktuelle Anmerkung: Cyanobakterien und Chloroplasten von Grünalgen heben offenbar unterschiedliche Schwellen für das Einsetzen von Autofluoreszenz. Das hat Eckhard gut gezeigt.

Herzliche Grüße

Detlef

[Klaus Herrmann]

Hallo zusammen,

na dann können wir den Bogen vielleicht mal schließen.

Auf Eckhards Bild fluoresziert kein Chlorophyll in einem Algenfaden, sondern ein Phycobilin in einem Cyanobakterium

Aus Wikipedia:

Die Phycobiline decken für die Photosynthese Wellenlängenbereiche ab, in denen das Chlorophyll nicht absorbiert. Die eingefangene Energie wird von Phycoerythrin gegebenenfalls auf Phycocyanin und von Phycocyanin auf das Chlorophyll übertragen. Dabei ist die Quanteneffizienz der Phycobiline sogar höher als die des Chlorophylls.

Mit Hilfe dieser akzessorischen Pigmente können Blaualgen ausgesprochene Schwachlichtbereiche besiedeln, wie beispielsweise die Unterseite von Flussgeröll oder die Tiefenschichten von Gewässern. Sie können dabei ferner die sogenannte Grünlücke der Chlorophyllabsorption nutzen.

Ich hatte bezweifelt - und tue das immer noch - dass mit der Polarisation die rote Chlorophyllfluoreszenz angeregt und sichtbar gemacht werden kann. Ich habe das noch nie beobachtet und heute 2 Stunden nochmals vergeblich versucht.

Dann ist dieses von Eckhard beobachtete Phänomen wahrscheinlich ausschließlich auf diese Spezies beschränkt; und damit kann man nicht von einer Methode sprechen mit der man auf simplem Wege Fluoreszenz beobachten kann. Es funktioniert eben nur da.

Dennoch ist die Beobachtung bemerkenswert und ich frage mich, ob sie überhaupt schon in der wissenschaftlichen Literatur zu finden ist, geschweige den untersucht ist? Könnte man locker als Diplomarbeit für einen Physikochemiker ausgeben!

Offensichtlich ist die Differenzierung über die Lichtintensität zu erzielen. Unterhalb einer bestimmten Schwelle wird Chlorophyll noch nicht angeregt zur Emission, während die Phycobiline im Schwachlichtbereich schon absorbieren und dann auch emittieren - vielleicht auch in der oben erwähnten Energiekaskade ans Chlorophyll weiter geben und das emittiert dann.

Mit schwach leuchtenen Grüßen - ich bleibe bei der konventionellen Methode, wie sicher mehr als 99% der Fluoreszenzmikroskopiker!

[peter-h]

Liebe Fluoreszenzler,

mir leuchten einige Punkte nicht ein, aber was solls.
Wenn aber von kräftiger Leuchte 50 - 100 Watt + Polfilter + Digitalkamera über neuartige Effekte berichtet wird, so klingen bei mir die Alarmglocken. Denn :

1. Bei einer Halogenleuchte mit ca. 3200 Kelvin liegt das Strahlungsmaximum bei 900nm (leicht nachzurechnen)
2. Polfilter - auch gekreuzt - werden ab ca. 850nm wieder herrlich transparent
3. Nur Optimisten glauben, dass Digitalkameras mit IR-Sperrfilter keine IR-Strahlung mehr aufnehmen (weil es so im Prospekt steht)

Es können also in solchen Kombinationen verdeckte Effekte auftreten und etwas vorgaukeln. Daher meine Zweifel, ob es wirklich eine Fluoreszenz war, oder ...... ?

Nachdenkliche nächtliche Grüße
Peter H.

[treinisch]

Liebe Fluoreszenzexperten,

leider fehlt mir noch die ein oder andere Erleuchtung:

• mir scheint, dass allen ausser mir selbstverständlich ist, dass die Fluoreszenz der Chloroplasten nicht polarisiert ist. Ich hätte ehrlich gesagt gedacht, dass sie genau so polarisiert ist wie das Anregungslicht. Wo liegt denn der Denkfehler?
• hat jemand einen Tipp für mich, wieso es eine Intensitätsschwelle für Fluoreszenz gibt? Ich hätte gedacht, dass es ab dem ersten Photon losgeht, so es die richtige Energie hat.

Vielen lieben Dank

Timm

[Detlef Kramer]

Lieber Timm,

deine erste Frage kann ich physikalisch präzise nicht beantworten. Aber, andersherum gefragt: warum sollte das Fluoreszenzlicht polarisiert sein? Es wird von ungeordnet ausgerichteten Molekülen emittiert. Es handelt sich ja nicht um eine Reflexion.

Zu Deiner zweiten Frage: Das Licht wird von den Chlorophyll-Molekül-Komplexen absorbiert und die Energie wird zur Spaltung von Wasser verwendet und nicht zur Erzeugung von Fluoreszenzlicht. Lediglich dann, wenn zu viel Licht absorbiert wird, wird dieses als Licht mit einer anderen Wellenlänge abgegeben um eine Schädigung der Moleküle zu vermeiden. Es wird also nur die überschüssige Energie abgegeben, daher die Schwelle.

Herzliche Grüße

Detlef

[treinisch]

Hallo Detlef,

herzlichen Dank!

deine erste Frage kann ich physikalisch präzise nicht beantworten. Aber, andersherum gefragt: warum sollte das Fluoreszenzlicht polarisiert sein?

Ich hätte mir das so gedacht: Es gibt in meiner Vorstellung einen Dipol für die Absorption und einen für die Emission. Vielleicht sind beide parallel, müssen sicher nicht, spielt aber auch keine Rolle.

Nun habe ich in der Probe eine große Menge willkürlich ausgerichteter Absorptionsdipole, aber diejenigen, die ungefähr parallel zu der Polarisationsebene ausgerichtet sind werden optimal Energie absorbieren, alle anderen entsprechend weniger. Mein Bauchgefühl würde sagen, dass die Absorption ungefähr proportional zum Cosinus des Winkels sein könnte. Wenn das so wäre, und die beiden Dipole (Emission und Absorption) wären parallel, wären immerhin über 50% des emittierten Lichtes im Bereich von ±15° von der Polarisationsebene des einfallenden Lichtes, was sich doch sicher deutlich auf die Intensität nach dem Analysator auswirken würde.

Vorausgesetzt, dass Molekül dreht sich nicht zu sehr innerhalb der paar Nanosekunden zwischen Absorption und Emission.

Zu Deiner zweiten Frage: Das Licht wird von den Chlorophyll-Molekül-Komplexen absorbiert und die Energie wird zur Spaltung von Wasser verwendet und nicht zur Erzeugung von Fluoreszenzlicht. Lediglich dann, wenn zu viel Licht absorbiert wird, wird dieses als Licht mit einer anderen Wellenlänge abgegeben um eine Schädigung der Moleküle zu vermeiden. Es wird also nur die überschüssige Energie abgegeben, daher die Schwelle.

Ach so, danke!

Herzliche Grüße

Timm

[reblaus]

Hallo Timm -

die Photosynthese ist doch eine kompliziertere Angelegenheit. Es handelt sich bei der Chlorophyllfluoreszenz selten um Nanosekunden, sie dauert überwiegend wesentlich länger und es gibt auch die verzögerte Fluoreszenz, von der ein kleiner Bruchteil über Minuten andauern kann.

Viele Grüße

Rolf

[treinisch]

Hallo Timm -

die Photosynthese ist doch eine kompliziertere Angelegenheit. Es handelt sich bei der Chlorophyllfluoreszenz selten um Nanosekunden, sie dauert überwiegend wesentlich länger und es gibt auch die verzögerte Fluoreszenz, von der ein kleiner Bruchteil über Minuten andauern kann.

Hallo Rolf,

eieiei! Das ist natürlich lang. Wie beweglich ist so ein Chlorophyll denn? Bestimmt ist es doch sehr schwer?

Aber andererseits, was wäre denn, wenn die Blaualgen so polarisiert fluoreszieren, dass es einigermaßen zum Analysator passt und Chlorophyll in den Algen eben nicht polarisiert und damit natürlich nur einen Bruchteil der Intensität hätten?

Aber vermutlich ist die Kramersche Schwellenhypothese als Erklärung wohl überlegen.

Herzlichen Dank

Timm

[Bernhard Lebeda]

Lieber Timm,

deine erste Frage kann ich physikalisch präzise nicht beantworten. Aber, andersherum gefragt: warum sollte das Fluoreszenzlicht polarisiert sein? Es wird von ungeordnet ausgerichteten Molekülen emittiert. Es handelt sich ja nicht um eine Reflexion.

...na ja, aber es wird doch hier durch den Analysator betrachtet, also ist es polarisiert.  Dass die Fluoreszenz so stark ist, dass sie im DF durch einen Polfilter immer noch zu sehen ist, habe ich schon vor zwei Jahren nicht glauben können. Aber als Nicht-Physiker vertieft man das lieber nicht.  

Und was ist mit Peters Einwänden? Die scheinen mir sehr plausibel.


Viele Mikrogrüsse

Bernhard


Tante Edit: ok.ok.  man sollte nicht vor dem Mittagessen mit leerem Magen posten. Jetzt hab ich Timms Frage verstanden. Insofern ist mein obiges Geschreibsel Nonsense, meu culpa!

[reblaus]

Hallo -

in der Tat finde ich Peters Argumente auch als die naheliegendsten und die wären als erstes zu untersuchen -

aber unabhängig davon wollte ich für Timm noch auf die theoretische Erwägung hinweisen, dass die Energie eines von einem Chlorophyllmolekül "eingefangenen" Photons über eine Reihe unterschiedlich modifizierter Chlorophyllmoleküle weitergereicht wird, bevor sie im Reaktionszentrum landet. Wenn sie dort nicht abgenommen wird, entsteht Fluoreszenz, die aber von ganz anderen Chlorophyllmolekülen ausgeht, als von dem als ersten angeregten und die dürften nichts mehr davon wissen in welche Richtung das Erregerlicht polarisiert war.

Viele Grüße

Rolf

[Eckhard F. H.]

Hallo Rolf,
eine interessante und anschauliche Schilderung. Dazu aber ein paar Fragen:

dass die Energie eines von einem Chlorophyllmolekül "eingefangenen" Photons über eine Reihe unterschiedlich modifizierter Chlorophyllmoleküle weitergereicht wird, bevor sie im Reaktionszentrum landet.

Was ist ein ´Reaktionszentrum´?

...entsteht Fluoreszenz, die aber von ganz anderen Chlorophyllmolekülen ausgeht

Demnach geben mehrere Moleküle die Anregungsenergie eines Photons ab, richtig?
Leicht verwirrter Gruß
EFH

[reblaus]

Hallo Timm -

der thread ist jetzt doch etwas weit von der Fluoreszenz abgeglitten und es macht hier keinen Sinn in der Photosynthese bröckchenweise weiter in die Tiefe zu gehen - als Anfangslektüre empfehle ich dazu den ordentlichen Wikipedia-Artikel

http://de.wikipedia.org/wiki/Photosynthese

Viele Grüße

Rolf

[wilfried48]

Hallo,

der Effekt ist physikalisch möglich und die damalige Erklärung wurde nicht angezweifelt:

http://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=396.msg1499#msg1499

Ich verstehe daher die jetzige Skepsis nicht.

Dass die Rotfluoreszenz in dem Algenfaden bei Eckhard nicht sichtbar ist und im aufsitzenden Cyanobakterium dagegen deutlich sichtbar ist könnte ein Intensitätsproblem sein.

Die Rotfluoreszenz im Chlorophyll der Alge wird hauptsächlich durch blau angeregt, wo die Halogenlampe schwach ist und von depolarisierten Streulicht, das den Analysator passieren kann, überstrahlt.
Die sichtbare Fluoreszenz der Cyanobakterien wird dagegen eher vom kräftigen grünen Licht der Halogenlampe angeregt und ist daher kräftiger als das Streulicht.

Das könnte man sehr schnell klären, wenn man die POL-Dunkelfeldanordnung mal mit eine kräftigen blauen LED betreibt. Dann wäre auch die IR Kameraartefaktevermutung von Peter geklärt.

viele Grüsse
Wilfried