Normalesmikroskop mit fluoreszenz ausstatten?

[jibi]

Hallo allen Pol- und Fluoreszenzfreunden,

nachdem ich diese Beiträge mit stiller Freude mitlas, muss ich doch gewissermaßen als fast letztes Wort etwas Physik mit einbringen bezüglich Polarisation und Fluoreszenz.

1. Fluoreszenz ist die Abstrahlung von Photonen durch ein dazu veranlagtes Molekül, das zuvor durch  energiereichere  Photonen angeregt wurde. Die notwendige Energieschwelle (Wellenlänge) ist spezifisch für das betreffende Molekül, ebenso die Wellenlänge der Fluoreszenz. Dem Molekül ist es dabei egal, ob die anregenden Photonen polarisiert eintreffen oder unpolarisiert. Eventuell mag es bei ganz speziellen Einkristallen Sonderfälle geben, sind mir aber in meiner Berufspraxis nicht bekannt geworden.

2. Die Photonen der Fluoreszenz sind grundsätzlich unpolarisiert. Dies begründet sich aus der Quantenmechanik. Näheres kann bei Wikipedia oder jedem guten Physikbuch entnommen werden.

3. Die Sperrfilter bei der Fluoreszenz-Mikroskopie dienen a) der Gesundheit des Auges bei UV-Anregung, und b) der Kontrastverbesserung bzw. Vermeidung der Überblendung, wenn der Sensor (Auge, Fotoschicht oder CMOS/CCD) auf die anregende Wellenlänge anspricht.
Polfilter werden zwar manchmal als Quasi-Neutralfilter eingesetzt, sind es aber materialbedingt bestimmt nicht,bzw. nur im sichtbaren Bereich.
Die in den Beiträgen aufgeführten funktionierenden Beispiele sollten keineswegs als grundsätzliche Funktionsweise angesehen werden.  Bei schwacher Fluoreszenzausbeute sieht man nichts, bei starker UV-Anregung sehe ich eine Gefahr für das experimentierfreudige Auge.
Ein Sperrfilter ist so teuer nicht. 

Mit besten Grüssen an alle fluoreszierende
Jürgen


   

[Klaus Herrmann]

Hallo Jürgen,

da Du ja offensichtlich ein Fachmann bist wollte ich Dein "abschließendes Wort" doch noch mal aufgreifen um zu vertiefen.

Dass die Fluoreszenzstrahlung nicht polarisiert ist wurde schon vorher mehrfach vermutet und ist auch plausibel - warum sollte sie auch?

Damit ist der eingangs vermutete Mechanismus zumindest theoretisch möglich:

mit linear polarisiertem Licht wird  - schwach - angeregt; das polarisierte Licht wird im Analysator fast vollständig gelöscht und die - schwache - nicht polarisierte Fluoreszenzemission wird im Analysator wieder linerar polarisiert - und dadurch nochmal geschwächt erscheint sie endlich im Auge des Betrachters, bzw dem Kamerasensor.

Das Fluoreszenzlicht ist aus meiner 30-jährigen Fluoreszenzerfahrung mitunter etwas gering intensiv.

Kannst Du denn mal die Schwächungsfaktoren abschätzen um zu überschlagen, was denn bei dieser Anordnung denn noch an Fluoreszenzlicht ankommt?

Dass die "Methode" keine Alternative ist zu den üblichen Anordnungen mit selektiver Anregung (durch Filter oder schmalbandige Lichtquellen) das ist sicher allgemein akzeptiert, aber ist sie denn überhaupt möglich?

Die ganz banale Erklärung: doppelbrechende Substanz gibt bei gekreuzten Polarisatoren einen Effekt, wäre doch auch eine Erklärung? Wenn die Substanz zirkular polarisiert würde man beim Drehen doch keine Vorzugsrichtung erkennen?

[treinisch]

Hallo Jürgen,

Niemand hat behauptet, dass Fluoreszenz zu einer Polarisation von eingangs unpolarisiertem Licht führen könne.

Als letztes Wort will ich deine Statements deswegen nicht stehen lassen. Ich hätte es nett
gefunden wenn du die ein oder andere Quelle zitiert hättest. Was die reine Physik angeht
gab es meines Erachtens hier auch wenig Diskussion. Die Streitpunkte die ich gesehen habe,
drehten sich eher um biochemische Fragen.

Grundsätzlich bin ich der Meinung, dass Detlef und Wilfried wohl die relevanten Erklärungen geliefert haben.

Aber:

Die notwendige Energieschwelle (Wellenlänge)

Hast Du eine Quelle für die Schwelle? Meines Erachtens handelt es sich um ein Resonanzphänomen, es gibt also eine optimale Wellenlänge und einen schmalen Bereich drumherum! Oberhalb des Optimums ist genau so schlecht, wie unterhalb.

ist spezifisch für das betreffende Molekül, ebenso die Wellenlänge der Fluoreszenz. Dem Molekül ist es dabei egal, ob die anregenden Photonen polarisiert eintreffen oder unpolarisiert.

Einem einzelnen Molekül ist das ganz und gar nicht egal! Hast Du eine Quelle dafür? Man berücksichtigt das normalerweise nicht, weil man normalerweise nicht mit polarisiertem Licht arbeitet, aber nur wenn das Licht exakt in der Ebene des absorbierenden Dipols polarisiert ist, wird es ohne Verluste absorbiert. Ich hatte das schon erläutert. Kannst Du physikalisch darlegen, warum das anders sein sollte? Man kann das doch auch leicht beobachten: bringt man einen organischen Farbstoff der mechanisch länger als breit ist meinetwegen in PVC/THF oder wsrg. Polyvinylalkohol o.ä. ein und lässt eindampfen, streckt dann, hat man einen simplen Polfilter. In Lösung ist das oft egal, weil die Dipole gleichmäßig über alle Orientierungen verteilt sind.

Dennoch kommt es auch in Lösungen bei polarisierter Anregung zu einer polarisierten Emission, wenngleich mit einer Streuung durch die Orientierung der Moleküle und eventuelle Veränderungen derselben. In meinem Posting habe ich das erläutert. Wenn die Erläuterung falsch ist, dann sag doch einfach an welcher Stelle! Ich lasse mich gerne präzise und informativ belehren!

Eventuell mag es bei ganz speziellen Einkristallen Sonderfälle geben, sind mir aber in meiner Berufspraxis nicht bekannt geworden.

Fluoreszenzpolarisation ist ein durchaus verbreitetes Routineverfahren zum Beispiel zu Bestimmung von Bindungskonstanten. Das geht unter Umständen sogar ohne Fluoreszenzmarker.

Herzliche Grüße

Timm

[Eckhard]

Hallo,

mehrere Anmerkungen zu der Diskussion der vergangenen Tage:

Die Halogenlampe ist mit einem Infrarotfilter versehen. Über den Wirkungsgrad kann ich nichts sagen - ich verlasse mich darauf, dass die Firma Zeiss keine Generation von halbblinden Mikroskopikern hinterlässt!

Eine Wechselwirkung mit dem Infrarotfilter der Kamera ist auszuschliessen - die Fluoreszenz ist auch im Okular zu beobachten.

Das Drehen des Tisches hat keinen Einfluss auf die Intensität oder die Farbe.

Auf Eckhards Bild fluoresziert kein Chlorophyll in einem Algenfaden, sondern ein Phycobilin in einem Cyanobakterium

Phycobilin fluoresziert orange und nicht rot!


Ich kann den Effekt bei Cyanobakterien, Kieselalgen und Rotalgen nachstellen. Nicht ab und zu, sondern immer.

Ein positiver Einfluss der Zellwand kann ausgeschlossen werden - austretendes Plasma mit Chlorophyll a zeigt dieselbe Autofluoreszenz.



Die interessante Frage ist natürlich, warum zeigen Grünalgen diesen Effekt nicht? Ursprünglich hatte ich dies auf die schützende Funktion der Zellulose Zellwand geschoben. Aber austretendes Plasma mit Chlorophyll in zerquetschten Grünalgen zeigte diesen Effekt auch nicht. Ich denke daher, dass die zur Autofluoreszenz nötige Lichtmenge von der Art des Chlorophylls abhängig ist. Für das in den Grünalgen vorkommende Chlorophyll b scheint die Lichtmenge in meinem Aufbau nicht ausreichend zu sein.

Ich bin kein Biologe oder Chemiker, aber ich kann mir nicht vorstellen, dass Autofluoreszenz bei Chlorophyll unter Beibehaltung der Schwingungsebene passiert.


Das Nachstellen sollte für Herrn Jülich in seinem Vorführraum keine 10 Minuten dauern. DIK Schieber vorher entfernen!

Herzliche Grüsse
Eckhard

[treinisch]

Ich bin kein Biologe oder Chemiker, aber ich kann mir nicht vorstellen, dass Autofluoreszenz bei Chlorophyll unter Beibehaltung der Schwingungsebene passiert.

Hallo Eckhard,

bei Chlorophyll kann ich es mir bis auf weiteres auch nicht mehr vorstellen, siehe Beiträge von Rolf!

Viele liebe Grüße

Timm

[peter-h]

Hallo Eckhard,

der wichtigste Satz für mich :
Eine Wechselwirkung mit dem Infrarotfilter der Kamera ist auszuschliessen - die Fluoreszenz ist auch im Okular zu beobachten.
Nun allerdings grüble ich noch mehr, wieso ich mit der Anordnung keinen Schimmer einer Fluoreszenz erkennen kann.

Viele Grüße
Peter

[jibi]

Hallo nochmals,
das habe ich nun davon, wenn ich vereinfachenden Senf zu einer sehr komplexen Thematik abgeben will.
Meine Statements bezogen sich ausschließlich auf die Fluoreszenz-Mikroskopie mit biologischen Proben. Auch die Titulierung "Fachmann" (@Klaus) muss ich dankend zurückgeben, ich habe in meiner aktiven Zeit nur einige kleine Teilabschnitte der Fluoreszenz beackert.
Ich gelobe, in Zukunft vereinfachende Aussagen tunlichst ausführlich mit Literaturquellen und Zitaten zu schmücken oder besser: sie mir verkneifen.


@Timm:
Du hast natürlich recht, wenn Du das einzelne Molekül betrachtest. Das anregende Photon muß ja erst vom Molekül absorbiert werden, damit es eine Fluoreszenz auslösen kann. Deshalb gibt es auch einen strengen Zusammenhang von Dipol und der Schwingungsebene des eintreffenden Photons. In der biologischen Probe sind die zu aktivierenden Moleküle in der Regel bekanntlich deutlich unsortiert aufgestellt, weshalb man zur besseren Ausbeute ein möglichst breites Angebot (also unpolarisiert) einstrahlen sollte. Bei speziellen Proben (z.B.Mineralogie) kann es durchaus Sinn machen, der besseren Ausbeute wegen mit polarisierter Anregung zu arbeiten. Bezüglich der Wellenlänge der Anregung ist Deine Aussage ebenfalls richtig: siehe unten.
Zur Frage der Polarisationsebene der Fluoreszenz: meines Wissens erfolgen die Übergange von Aktivierung und Deaktivierung des beteiligten Elektrons nicht gekoppelt, woraus eine nichtpolarisierte Fluoreszenz resultiert. Falls ich mich irre, kann ein gelernter Physiker nähere Aufklärung bringen.

@Klaus, Timm:
Die Erklärung zur Energieschwelle (Wellenlänge) steckt schon in der o.g. Absorption des Anregungs-Photons. Da in der Regel die Wellenlänge der Anregung kürzer ist als die Wellenlänge der Fluoreszenz (Ausnahme: Resonanz-Fluoreszenz), muß man zur Anregung eine starke Absorptionsbande des betreffenden Moleküls unterhalb der Fluoreszenz-Wellenlänge heranziehen. Und bekanntlich zeigen große organische Moleküle meist, nicht immer, breite UV-Absorptionsbanden. Deshalb die Anregung meistens im nahen UV. Ideal wäre natürlich eine durchstimmbare Quelle von 200-500nm, doch da beisst sich wohl doch Aufwand und Strahlhelligkeit. Aber bei der üblichen Fluoreszenz-Mikroskopie spielt das meist keine Rolle, da die verwendeten Fluorochrome und selbstfluoreszierenden  Naturstoffe in der Regel eine sehr breite UV-Absorption aufweisen.


Mit besten Grüssen
Jürgen

[TPL]

Der Trick ist doch wirklich gut: Anregungslicht kommt wegen der gekreuzten Polfilter nicht durch - wohl aber das rote Fluoreszenzlicht des Chlorophylls, das ja nicht polarisiert ist. Einschränkung ist natürlich, dass doppeltbrechende Strukturen Fluoreszenz vortäuschen/überlagern können.

Hallo Rolf,
die zusätzliche Dunkelfeld-Beleuchtung schaltet ja auch das Licht von im Präparat möglicherweise vorhandenen doppelbrechenden Strukturen weitgehend aus - jedenfalls deren flächenhafte Abbildung. Die Beschränkung auf die im Präparat gebeugten Strahlen scheint mir für die Kontrastierung (hier v.a. die Unterdrückung des Anregungslichtes) mindestens genauso wichtig wie die polaristionsoptische Ausblendung der Anregungsstrahlung.

Die Intensität eines primären, bzw. eines durch Doppelbrechung veränderten Lichtstrahls wäre i.a. so viel intensiver als ein sekundäres, durch eben diesen Strahl erzeugtes Fluoreszenz-Licht, dass die Fluoreszenz nicht erkennbar wäre. Deshalb, und zur Unterdrückung von möglichst allem unerwünschten (hier: ungebeugten) Licht muss neben der "Pol-Kontrastierung" noch eine zweite Kontrastierungsmethode her: Dunkelfeld-Beleuchtung eben.

Eckhards Methode ist möglicherweise bereits beschrieben und evtl. für viele professionelle Aufgabenstellungen zu unspezifisch. Aber deswegen finde ich sie umso eleganter und - wie schon vor 2 Jahren - genial! Sie widerlegt die immer wieder gepflegte Mär, man könne Fluorezenzbeobachtungen nur mit einem aufwändigen, empfindlichen und v.a. teuren Gerät realisieren und das dann auch bitte nur für gaaaanz spezielle Wellenlängen und Farbstoffe.

Preiswert und breitbandig fluoreszierende Grüße, Thomas

[Klaus Herrmann]

Hallo Thomas,

Selbst Auflicht-Fluoreszenz geht leichter, als man gemeinhin denkt (http://depatisnet.dpma.de...ger&action=einsteiger; als Titel "Gesteinsuntersuchungen" eingeben ).

Vielleicht habe ich die Patentschrift falsch verstanden, der Kniff ist doch, dass eine LED als Lichtquelle vorgeschlagen wird um HBO oder Ähnliches zu ersetzen. Aber es wird schon auch noch mit Anregungs und Sperrfiltern gearbeitet. (Dass das patentfähig ist?)

Also nicht vergleichbar mit den preiswerten "Polmikroskopen" die mit Polfiltern aus Plastik arbeiten und Kompensatoren aus einem Schnipsel Zellophanpapier, womit man schon mal schön bunt machen kann, aber optisch nicht ganz sauber ist.

[TPL]

Hallo Klaus,
welche Patentschrift?
Eckhard hatte früh in der Diskussion recht klar formuliert, dass er zusätzlich zum Pol-Kontrast auch Dunkelfeld-Kontrast einsetzt. Fluoreszenzphänomene (die übrigens auch da sind, ohne das man sie erkennen kann!), die bei Betrachtung eines wunderschönen Präparats von Robin Wacker mit einer soundso-Färbung zwischen gekreuzten Polarisatoren (aber ohne Dunkelfeld!) nicht sieht, bringen uns also nicht weiter...
Gruß, Thomas

[wilfried48]

Hallo,

ich habe das Fluoreszenz Prinzip mit Dunkelfeldkondensor und Polfiltern an einem Präparat mit Wacker 3A  Färbung mal ausgeführt. Mit Weisslicht Halogen 100 W sehe ich keine Fluoreszenz, da die Pol Filter im normalen Mikroskop ohne POL Optik nicht ganz dicht machen. Das mag bei Eckhardt besser sein, da er zumindest DIC Optik im Einsatz hat. Aber wenn ich mit der Blauen LED ohne Anregungsfilter anrege sieht man die Fluoreszenz schon.
Aber noch besser geht es mit einem Gelben Sperrfilter im Beobachtungsstrahlengang. Da hat man sowohl im Auflichtdunkelfeld als auch im Durchlichtdunkelfeld hervorragende kräftig leuchtende Fluoreszenz vor absolut dunklem Untergrund die der normalen Anregung über Anregungsfilter und dielektrischem Spiegel in nichts nachsteht.

Aber ob ein guter Auflicht- bzw. Durchlichtdunkelfeldkondensor  plus Sperrfilter viel billiger ist als ein Fluoreszenzkondensor?
Es ist vielleicht eine Alternative wenn man Dunkelfeld schon hat und nur noch den Sperrfilter braucht.

viele Grüsse
Wilfried

[Klaus Herrmann]

Hallo Thomas,

dass es um die Kombination von DF und Pol geht bei der beschriebenen Methode ist mir durchaus geläufig und wenn Du das liest, was ich geschrieben habe, dann sollte das deutlich werden, dass ich das begriffen habe.
Ich habe auch Beispiele gezeigt, wo mit einer Royalblue-LED (Du magst diese exakte Bezeichnung, wenn ich mich recht erinnere) - unterstützt durch DF - im Durchlicht Fluoreszenz gemacht wird. Bei mir aber konventionell mit einem LP 520 Sperrfilter.

welche Patentschrift?

Ist das keine Patentschrift auf die Du hingewiesen hast in Deinem Link? Mir schien das so! Das was ich gelesen habe geht in feiner Patentmanier über 10 Seiten. Kannst Du denn das Wesentliche in ein paar prägnanten Sätzen zusammenfassen - offensichtlich ist mir was Entscheidendes entgangen.

Ich muss sagen, dass sich mir die verblüffend einfache Methode noch nicht erschlossen hat; ich kriegs nicht hin! Peter Höbel offensichtlich auch nicht - aber vielleicht sind wir die Einzigen?

Du bist doch auch gut ausgerüstet, kannst Du denn nicht mal was zeigen?

[TPL]

(...)ob ein guter Auflicht- bzw. Durchlichtdunkelfeldkondensor  plus Sperrfilter viel billiger ist als ein Fluoreszenzkondensor?

Lieber Wilfried,
nach meiner Erfahrung ist das nicht nur billiger, sondern v.a. auch viel universeller. Anders als mit dem sehr spezifischen Ansatz "ein Farbstoff, ein Anregungsfilter, ein Sperrfilter" (nicht völlig ernst gemeint) bietet Eckhards Pol-Dunkelfeld-Methode den Vorzug, Fluoreszenz in ganz verschiedenen Banden erkennen zu können. Zugegeben, nicht immer sehr intensiv, aber in Hyperions Frage ging es ja um erstmal um die Möglichkeit, möglichst schlicht zur Fluoreszenzbeobachtung zu kommen.

Und das geht (und zwar auch ohne Sperrfilter)! Ich habe es vor 2 Jahren auf Eckhards ersten Bericht hin ausprobiert und war begeistert, einen weiteren Weg zu finden, dieses faszinierende Phänomen mit "Bordmitteln" beobachten zu können. Auch wieder zugegeben: unter meinen Bordmitteln befinden sich Pol-Objektive, die das Gesichtsfeld zwischen gekreuzten Polarisatoren überhaupt nicht aufhellen. Aber es ging auch mit eher gewöhnlichen Achromaten (63/o,80 und 40/o,85 Öl) sehr gut.

Schönen Gruß, Thomas

[wilfried48]

Lieber Thomas,

ich werde es nachher mal an meinem Polarisationsmikroskop versuchen. Aber wenn es nur unter dieser Voraussetzung
gut geht wäre das für mich keine Alternative zum klassischen Fluoreszenzmikroskop da es mindestens doppelt so teuer war und auch heute noch ist.
Mit billigen Polfiltern ohne Poloptik an einem Routinemikroskop mit lichtschwacher Halogenbeleuchtung wird man sicher nicht glücklich.

viele Grüsse
Wilfried

[Detlef Kramer]

Also,

mir geht langsam der rote Faden verloren. Deshalb nur noch eine Anmerkung von mir: das Ganze kann natürlich nur mit lebendem Pflanzenmaterial funktionieren. Präparate, mit Wacker gefärbt - nee dat wird nix!

Ansonsten finde ich Eckhards Ansatz in sich logisch - hoffe ich habe nichts übersehen.

Herzliche Grüße

Detlef