Normalesmikroskop mit fluoreszenz ausstatten?

[treinisch]

Hallo Jörg,

Jede fluoreszierende Substanz oder Struktur muss man sich zusammengesetzt aus zwei Dipolen vorstellen: Der eine Dipol nimmt das Erregerlicht auf (Absorptionsdipol), und der andere Dipol gibt das Fluoreszenzlicht ab (Emissionsdipol). Jedes einzelne emittierte Fluoreszenzlicht-Quant bzw. jeder einzelne emittierte Lichtwellenzug schwingt in derjenigen Ebene, welche der Ausrichtungsebene des emittierenden Dipols entspricht. Umgekehrt wird ein einfallendes Erregerlicht-Quantum bzw. ein einfallender Erregerlicht-Wellenzug in umso höherem Maße absorbiert, wie dessen Schwingungsebene mit der Ausrichtungsebene des Absoptionsdipols übereinstimmt. Eine maximale Übereinstimmung liegt vor, wenn die einfallende Erregerlichtwelle parallel zur Längsache des Absorptionsdipols schwingt und daher diesen Dipol sozusagen auf voller "Breitseite" trifft. In analoger Weise wird eine Fluoreszenzlichtwelle von der "Breitseite" des Emissionsdipols emittiert, so dass der emittierte Lichtwellenzug parallel zur Längsachse des Emissionsdipols schwingt.

Exakt so hatte ich das gemeint.

In fluoreszierenden biologischen Proben (Lebendmaterial) sind die insgesamt vorhandenen Dipole in ihrer Orientierung zufallsverteilt und wechseln ständig ihre Position im Raum.

Das ist erstmal nicht nur bei Lebendmaterial so, sondern bei allen Proben in Lösung. Fluoreszenzpolarisation als Messmethode wird regelmäßig in Lösung angewendet.

Daher ist das von solchen Proben emittierte Fluoreszenzlicht insgesamt nicht polarisiert, und zwar unabhängig davon, ob das Erregerlicht polarisiert ist oder nicht.

Gerade eben doch! Die zufällige Verteilung spielt in dieser Vorstellung erstmal keine Rolle, weil die ,,falsch" orientierten Moleküle nicht so gut absorbieren und daher weniger zum Fluoreszenzlicht beitragen. Wie gesagt, Fluoeszenzpolarisation wird regelmäßig mit organischen Molekülen, DNA und Proteinen in Lösung angewandt.

Polarisiertes Fluoreszenzlicht kann folglich nur in Sondersituatioinen emittiert werden, wenn mehr oder weniger alle Emissionsdipole parallel zueinander ausgerichtet sind.

Nein, das ist ein Missverständnis, entschuldigung! Was ich meinte ist, dass das emittierte Licht in der selben Ebene polarisiert ist, wie das absorbierte Licht, wenn der fiktive Emissionsdipol parallel zum fiktiven Absorptionsdipol ist. Ist der Apsorptionsdipol um 10° gegen den Emissionsdipol verdreht, ist das bei allen Molekülen so, und das polarisierte Emissionslicht ist eben um 10° gegen die Polarisationsebene des Einfallenden Lichtes verdreht.

Die Emissionsdipole sind untereinander natürlich statistisch verteilt und niemals parallel, was aber keine Rolle spielt, weil ja die falsch angeordneten Dipole nur schwach emittieren, weil sie auch vorher nur wenig Energie über den Absorptionsdipol aufgenommen haben.

Dies dürfte wahrscheinlich nur in manchen kristallinen oder einigen polymeren Strukturen der Fall sein, spielt also für biologisch-medizinische Anwendungen keine Rolle.

s.o. Fluoreszenzpolarisation ist ein Standardverfahren zur Bestimmung von Bindungskonstanten in der biologischen und medizinischen Forschung und zwar in Lösung und nicht in Kristallen oder festen Polymeren.

Wenn das Erregerlicht unpolarisiert ist, kommt wahrscheinlich für jeden vorhandenen Absorptionsdipol ein Lichtwellenzug in Betracht, welcher "zufällig" parallel zu dessen Ebene schwingt, so dass die Energie des Erregerlichtes im Bezug auf ein Ansprechen möglichst vieler Absorptionsdipole besonders gut ausgenutzt werden dürfte. Wird das Erregerlicht polarisiert, werden nur diejenigen Absorptionsdipole voll angesprochen, welche "zufällig" in der Polarisationsebene des Erregerlichtes liegen. Aber auch hier bleibt das emittierte Fluoreszenzlicht unpolarisiert, so lange die Emissionsdipole in ihrer Raumorientierung zufallsverteilt sind.

Das ist soweit fast das was ich meinte, bis auf einen Punkt: Bei normalen Molekülen, auch DNA oder Proteinen ist der Absorptionsdipol fest zum Emissionsdipol orientiert. Eine räumlich zufällige Anordnung von Emissionsdipolen zu ihren dazugehörigen Absorptionsdipolen wäre eine seltene Ausnahme. Deswegen gilt gerade wegen dem was du schreibst: Pol rein => Pol raus.

Bei Chloroplasten könnte es allerdings nach dem was Jörg schreibt anders sei.

Diese Zusammenhänge erklären, dass die Intensität des Fluoreszenzbildes bei bei den gezeigten Blaualgen unverändert bleibt, wenn der Objekttisch gedreht wird, auch dann, wenn das Erregerlicht polarisiert ist und mit einem gekreuzten Analysator nach der Objektpassage ausgeschaltet wird. Auch geht bei dieser Methode -zumindst theoretisch betrachtet - keine visuelle Information im Vergleich zur herkömmlichen Fluoreszenztechnik verloren, sofern die Energie des Erregerlichtes und die Intensität des emittierten Lichtes ausreichend sind.

Das ist auch bei Pol rein => Pol raus so. Eine normale Probe mit meinethalben kurzsträngiger DNA würde auch keine Intensitätsänderung zeigen, wenn man die Polarisationebene verdreht (analog zu Probe dreht).
[/quote]

Viele liebe Grüße

Timm

[reblaus]

Hallo -

nicht dass ich die Diskussion auf meine unphysikalisch primitive Ebene ziehen wollte -
aber vielleicht könnte man das noch mit einbeziehen:

a) In den 1930-Jahren entdeckte Kautsky (mit bloßem, gut dunkel adaptierten  Auge und geeigneten Filtern), dass ein intaktes grünes Blatt, nachdem es längere Zeit in der dunklen Schublade verweilt hatte, beim schnellen Verbringen in photosynthetisch aktives Licht relativ "stark" (rot) fluoreszierte. Diese Fluoreszenz ging dann innerhalb von etwa 3 Minuten auf etwa ein Zehntel zurück (= Kautsky-Effekt).
Erklärung: Die eingestrahlte Energie kann zunächst nicht abgenommen werden, da es einige Zeit braucht, bis alle Einzelstufen des Elektronentransports synchronisiert sind. Ein Teil der nicht verwerteten Energie wird als Wärme, ein weiterer als Fluoreszenz wieder abgestrahlt. Beweis: Behandlung des Blattes mit Hemmstoffen für den Elektronentransport (z.B. die Herbizide Simazin oder Diuron) verhindert den Rückgang der Fluoreszenz.

b) Man nehme ein Blatt, lege es einige Minuten auf das Fensterbrett in die Sonne und verbringe es eilig ins Dunkle unter einen Photomultiplier. Dann kann man ein "Nachleuchten" messen, das zwar exponentiell abnimmt aber noch über Minuten zu beobachten ist.

Frage: Die Energie für diese verzögerten Fluoreszenzerscheinungen hat einen weiten Weg im Photosynthesesystem hinter sich - ob das Licht wohl immer noch polarisiert ist, falls man das Blatt mit polarisiertem Licht bestrahlt hat?

Viele Grüße

Rolf

[Detlef Kramer]

Lieber Rolf,

Frage: Die Energie für diese verzögerten Fluoreszenzerscheinungen hat einen weiten Weg im Photosynthesesystem hinter sich - ob das Licht wohl immer noch polarisiert ist, falls man das Blatt mit polarisiertem Licht bestrahlt hat?

Diese Frage ist ja wohl rhetorischer Natur?

Herzliche Grüße

Detlef

[Piper]

Hallo Timm,

vielen Dank für Deine weitergehenden Erläuterungen, die ich nun, wie ich hoffe, gut verstanden habe. Wenn ich richtig schlussfolgere und ein Drehen des Objekttisches keine Aussage erlaubt, ob das emittierte Fluoreszenzlicht polarisiert ist, oder nicht, bliebe doch nur der Weg, dies herauszufinden, wenn man direkt vor das Okular bzw-. vor ein beobachtendes Auge einen Polfilter hält und diesen während der Beobachtung dreht. Sofern das Fluoreszenzlicht polarisiert ist, müsste es sich durch Drehen dieses Polfilters doch in seiner Intensität verändern lassen, ansonsten nicht.

Ich halte die Frage nach der Polarisation für wesentlich, da doch der Bärenanteil des Fluoreszenzlichtes bei der Polarisationsmethode verlorengehen müsste, wenn das Fluoreszenzlicht in etwa parallel zur Ebene des polarisierten Erregerlichtes schwingt und der Analysator hierzu gekreuzt ist. Dann dürfte man doch eigentlich nichts mehr oder nicht mehr viel hiervon sehen, oder??? Der Umstand, dass man die Blaualgen trotzdem fluoreszierend sieht, müßte demnach doch "beweisen", dass bei diesem Objekt das emittierte Fluoreszenzlicht unpolarisiert ist, oder dessen Schwingungsebene deutlich von derjenigen des Erregerlichtes abweicht. Erklärungen zu diesem Phänomen wurden ja schon gepostet.

Vielleicht könnte Eckhard mal in einer ruhigen Minute einen Polfilter vor sein Auge halten, diesen drehen und uns mitteilen, ob sich an der Helligkeit der fluorszierenden Strukturen etwas ändert. Dies könnte doch aufschlussreich sein.

Schöne Grüße

Jörg

[treinisch]

a) In den 1930-Jahren entdeckte Kautsky (mit bloßem, gut dunkel adaptierten  Auge und geeigneten Filtern), dass ein intaktes grünes Blatt, nachdem es längere Zeit in der dunklen Schublade verweilt hatte, beim schnellen Verbringen in photosynthetisch aktives Licht relativ "stark" (rot) fluoreszierte. Diese Fluoreszenz ging dann innerhalb von etwa 3 Minuten auf etwa ein Zehntel zurück (= Kautsky-Effekt).
Erklärung: Die eingestrahlte Energie kann zunächst nicht abgenommen werden, da es einige Zeit braucht, bis alle Einzelstufen des Elektronentransports synchronisiert sind. Ein Teil der nicht verwerteten Energie wird als Wärme, ein weiterer als Fluoreszenz wieder abgestrahlt. Beweis: Behandlung des Blattes mit Hemmstoffen für den Elektronentransport (z.B. die Herbizide Simazin oder Diuron) verhindert den Rückgang der Fluoreszenz.

Hallo Rolf,

ein spannender Effekt. Ich habe mittlerweile ein wenig über Photosynthese gelesen und die Ursache für den Kautsky-Effekt ist, so habe ich gelesen, an der Stelle zwischen dem gebundenen Plastochinon Q_A und Q_B. Diuron zum Beispiel bindet wohl an die Bindungsstelle an die ansonsten das Q_B binden würde.

Würde das denn nicht dafür sprechen, dass in diesem Fall bei der Fluoreszenz die Emission durch genau das selbe Chlorphyll-Molekül erfolgt wie die Absorption? Das würde ja in diesem Fall für eine Polarisation sprechen, selbst wenn wegen der großen Stabilität des angeregten Zustandes die Lebensdauer recht lang ist, aber das Chlorophyll ist ja mechanisch mit dem gesamten Photosystem 1 gekoppelt, und somit doch eher schwer, oder?

Viel wichtiger: Wäre denn eine Vorgehensweise analog zu der von dir beschriebenen nicht der ideale Weg zu testen, ob die Abwesenheit der Fluoreszenz bei Eckhards Anordnung an der Fluoreszenz-,,Schwelle" liegt?

b) Man nehme ein Blatt, lege es einige Minuten auf das Fensterbrett in die Sonne und verbringe es eilig ins Dunkle unter einen Photomultiplier. Dann kann man ein "Nachleuchten" messen, das zwar exponentiell abnimmt aber noch über Minuten zu beobachten ist.

Frage: Die Energie für diese verzögerten Fluoreszenzerscheinungen hat einen weiten Weg im Photosynthesesystem hinter sich - ob das Licht wohl immer noch polarisiert ist, falls man das Blatt mit polarisiertem Licht bestrahlt hat?

Auch ich kann mir nicht vorstellen, dass hier Polarisation auftritt.

Viele liebe Grüße

Timm

[Piper]

Hallo,

hier noch ein kleiner Nachtrag zu meinem letzten Kommentar.
Natürlich setzt der von mir vorgeschlagene Test (Drehen eines vor dem Auge befindlichen Polfilters) voraus, dass mit einem normalen Fluoreszenzmikroskop gearbeitet würde, bei dem das Erregerlicht polarsisiert ist. Konkret könnte man hinter dem Erregerfilter einen Polfilter in den Strahlengang einbauen, so dass das Erregerlicht polarisiert zum Objekt verläuft. Zusätzlich könnte man einen drehbaren (!) zweiten Polfilter, der als Analysator wirkt, oberhalb des Objektivs vor dem Sperrfilter platzieren. Sofern das emittierte Fluoreszenzlicht polarisiert ist, müsste sich dessen Intensität bei Drehen des Analysators verändern. Sollte das Fluoreszenzlicht hingegen unpolarisiert sein,würde sich durch Drehen des Analysators nichts ändern.
Unter der Voraussetzung, dass die Eigenschaften von polarisiertem Licht bei Passage der Erreger- und Sperrfilter nicht verändert werden, könnte man natürlich auch den ersten Polfilter direkt an der Lichtquelle platzieren, d.h. vor dem Erregerfilter und den zweiten Polfilter auch hinter dem Sperrfilter, so z.B. auch vor dem beobachtenden Auge.
Wenn man nun bestimmte Objekte, die in der Fluoreszenzpolarisiation gut leuchten, z. B. die von Eckhard gezeigten Blaualgen, parallel mit einem so bestücken konventionellen Fluoreszenzmikroskop nachuntersuchen würde, könnte experimentell geklärt werden, ob das von diesem Objket emittierte Fluoreszenzlicht bei eintreffendem polarisiertem Erregerlicht ebenfalls polarisiert ist, oder nicht.
Zusätzlich könnte man in dem Fall, dass das Fluoreszenzlicht polarisiert ist, abschätzen, um wieviel Grad die Ebenen der Absorptions- und Emissionsdipole gegeneinander versetzt sind, wenn man die Winkelabweichung der eingestellten Ebenen des Polarisators und Analysators kennt (bezogen auf diejenige Analysatorstellung, bei der die Fluoreszenzintensität maximal ist).

Die letzten von Timm beigesteuerten Überlegungen lassen m.E. nun den Rückschluss zu, dass die Eckhardsche Fluoreszenzpolarisation wohl doch nicht geeignet ist, jegliche fluoreszierenden Objekte sichtbar zu machen, sondern nur solche, bei denen das emittierte Fluoreszenzlicht entweder unpolarisiert ist, oder bei denen die Ebene des polarisiert emittierten Fluoreszenzlichtes wesentlich von der Schwingungsebene des einfallenden Erregerlichts abweicht, sei es, weil sich die Moleküle im Zeitintervall zwischen Absorption und Emission in ihrer Lage im Raum hinreichend verändern, sei es, weil die Ebenen der Absorptions- und Emissionsdipole deutlich voneinander abweichen.

Dies könnte auch erklären, weshalb die lebenden Blaualgen gut in der Fluoreszenzpolarisation erkennbar sind, wohingegen ein Dauerpräparat mit Wackerfärbung in der Fluoreszenzpolarisation "unsichtbar" bleibt. In letzterem dürften nämlich die Absorptions- und Emissionsdipole parallel zueinander ausgerichtet sein und die fluoreszierenden Moleküle dürften sich, wenn überhaupt, nur sehr wenig in ihrer Position verändern. Somit würde bei einfallendem polarisiertem Erregerlicht das Fluoreszenzlicht in derselben Ebene polarisiert sein und folglich von dem in Kreuzstellung befindlichen Analysator geblockt werden. Und wenn man den Analysator verstellt, würde das wenige Fluoreszenzlicht direkt von dem Erregerlicht bzw. dem hiervon generierten Dunkelfeldbild überlagert.

Ich hoffe, dass diese Überlegungen so richtig sind und die geschilderten diskrepanten "Vorbefunde" erklären.

Schönes Wochenende

Jörg Piper

[peter-h]

Liebe Fluorenzianer,

sollte tatsächlich ein messender Mensch sich an dieses Thema trauen, so ist ihm doch sicher bekannt, dass im gesamten Strahlengang keine weiteren Polarisationselemente stecken dürfen. Damit scheidet Auflicht-Fluoreszenz nach meinem Verständnis aus, denn es gibt einen unter 45° stehenden Strahlenteiler !
Und selbst Durchlichtfluo. darf nicht über ein Bino- Trino- Tubus erfolgen, denn da sind Prismen verbaut.
Als Sensor funktioniert vermutlich auch nur eine monochrome Kamera ohne jede Automatikfunktion oder ein Fotomultiplier mit Meßblende oder ausgesuchte Si-Diode. Natürlich alle wesentlichen Komponenten stabilisiert.

Selbst bei Durchlichtfluo. wäre ich im Beleuchtungsstrahlengang durch die Umlenkung des Lichtes mit Spiegel sehr vorsichtig. Vermutlich also ein Sonderauf- und/oder Umbau an einem Mikroskop.

Sehe ich diese Punkte als übertrieben ?

Nachdenklich
Peter H.

[Piper]

Hallo, Herr Höbel,
ich teile Ihre Nachdenklichkeit. Daher schlug ich auch vorsorglich vor, die beiden Polfilter idealerweise so zu platzieren, dass die Erreger- und Sperrfilter außerhalb der Polfilter bleiben - wenngleich ich nicht aus dem Stehgreif weiß, ob die Polarisation durch solche Filter beeinflusst wird (könnte vielleicht auch von der Art ders Filter abhängen - Farbgläser versus Interferenzfilter). Dann hatte auch ich eine Durchlicht-Anregung vor Augen, so, wie Eckhard es beschrieben hatte. Damit entfällt ein Strahlenteiler. Grundsätzlich wäre auch ein Monokulartubus vorteilhaft, schon wegen der geringen Lichtausbeute. Ob darüberhinaus Prismen in einem Binotubus die Polarisation verändern, weiß ich nicht bzw. halte ich für fraglich; denn ansonsten müsste doch auch ein Standard-Polarisationsbild in einem Monotubus ohne Prismen anders aussehen als in einem Bino-oder Trinotubus mit Prismen (wenn ich jetzt keinem Denkfehler aufsitze).
Zusammenfassend müsste man wohl ein "archaisches" Fluoreszenzmikroskop verwenden, entsprechend der ersten Anfänge, bei welchem man auch noch beliebig am Strahlengang herumbasteln kann.
Herzlich-nachdenkliche Grüße
Jörg Piper

[peter-h]

Hallo Herr Piper,

vielleicht schaffe ich es in der nächsten Woche ein altes richtiges (weil alle Teile austauschbar) Mikroskop wie Standard 18 usw. oder Olympus BH-2 so umzurüsten dass keine unnützen Prismen oder Strahlenteiler im Strahlengang sind und nach Vorversuchen mit einer entsprechenden Kamera die Polarisation der Fluoreszenz zu untersuchen.
Falls es einen Effekt gibt, so erwarte ich ihn im 10e-2 bis 10e-3 Bereich.

Nachtrag:
Ein Schnellversuch zeigt bereits eine Teilpolarisation der Beleuchtungseinrichtung.
Testbedingung:
Kein Kondensor, kein Präparat, kein Objektiv, kein Bino- oder Trino sondern Ofenrohr ohne Optik, Kamera ohne Automatikfunktion mit Live-Mode Histogramm.
Beleuchtung mit stab. LED. Auf der Leuchtfeldblende ein drehbarer Polarisator.

Erklärung:
Es reicht bereits die Lichtumlenkung durch den Spiegel im Fuß des Olympus BH-2 um eine Teilpolarisation zu erzeugen.

Zusatztest:
Der Trinotubus verändert nocheinmal die Polarisation auch wenn auf 100% zum Fototubus geschaltet wird. Die Vermutung mit der Störung durch das Prisma ist damit bestätigt.

Viele Grüße
Peter H.

[peter-h]

Hallo Eckhard,

es liegt nun schon einige Tage zurück, aber ich habe noch nicht aufgegeben. Aus einem Verein für Aquarienkunde konnte ich mir frische Blaualgen besorgen. Wieder ein Versuch und wieder keine Fluotreszenz, so wie auf Deinen Aufnahmen schön zu sehen. Gibt es noch etwas zu beachten, was noch nicht erwähnt wurde?
Selbstverständlich leuchten diese Blaualgen in üblicher Auflichtfluoreszenz bei Blaulichtanregung ( 455nm ) wunderschön auf.

Viele Grüße
Peter

[Eckhard]

Hallo Peter,

ich bin derzeit in Los Angeles - leider ohne Mikroskop. Ich bin in 10 Tagen zurück und werde ein paar weitere Aufnahmen von Algen machen. Mal sehen, ob ich mit 100W Halogen auch Grünalgen zur Autofluoreszenz bekomme.

Bei Carl Zeiss ist dieser Effekt übrigens bekannt.

Herzliche Grüsse
Eckhard

[olaf.med]

@ Jörg Pieper,

Hallo

Ob darüberhinaus Prismen in einem Binotubus die Polarisation verändern, weiß ich nicht bzw. halte ich für fraglich; denn ansonsten müsste doch auch ein Standard-Polarisationsbild in einem Monotubus ohne Prismen anders aussehen als in einem Bino-oder Trinotubus mit Prismen (wenn ich jetzt keinem Denkfehler aufsitze).

Jedes Teilersystem beeinflußt die Polarisation des Lichts - mit einer Ausnahme: das von Max Berek entwickelte Prisma für die Auflichtmikroskopie.
http://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=8136.msg56715;topicseen#msg56715

Daher sitzt bei einem Polarisationsmikroskop der Analysator immer vor dem Binotubus. Um unliebsame Polarisationseffekte bei Untersuchung im linerar polarisierten Licht zu vermeiden muß man außerdem das Licht vor dem Binotubus "depolarisieren". Dafür gibt es teure Einrichtungen:
http://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=8509.0

Gruß, Olaf

[Jürgen Boschert]

Hallo zusammen,

diesen Polarisationseffekt kann jeder selbst mal nachvollziehen, wenn er nicht gerade ein Depolaristionsfilter in den Bino-Tubus eingebaut hat (Pol-Bino-Tuben haben das sicher, PZO-Binotuben hatten das generell): Wenn man ein homogenes Bild einstellt bei nicht allzu starker Helligkeit (muss nicht fokusiert sein), und nur einen drehbaren Polfilter entweder als Polarisator oder Analysator langsam dreht, kann man sich mit dem Drehen für die beiden Tubuseinblicke unterschiedliche Helligkeitsveränderungen wahrnehmen. Ich persönlich empfinde das dann durchaus als etwas unangenehm, es irritiert das binokulare Sehen. Die Prismen wirken dann eben für die beiden Einblicke als unterschiedlich ausgerichtete, feststehende Polfilter.

Betse Grüße !

JB

[olaf.med]

...... noch schlimmer: wenn man in einem Dünnschliff farblose Minerale im linear polarisierten Licht - also nicht bei gekreuzten Polarisatoren - fotografieren will, werden die, je nach Orientierung, durch die Pol-Effekte im Strahlenteiler schön pastellfarben bunt .

Gruß, Olaf

[Bernhard Lebeda]

...... noch schlimmer: wenn man in einem Dünnschliff farblose Minerale im linear polarisierten Licht - also nicht bei gekreuzten Polarisatoren - fotografieren will, werden die, je nach Orientierung, durch die Pol-Effekte im Strahlenteiler schön pastellfarben bunt .

Gruß, Olaf

Hallo Olaf

gibt es irgendeine behelfsmäßige Methode um zwischen Analysator und Tubus zu depolarisieren?


Viele Grüsse

Bernhard