Liebe Schwarzfärber,
so, nun kann ich meine ersten drei Versuche vorstellen. Mit recht wechselnden Ergebnissen.
Im ersten Versuch habe ich das Hamburger Kernschwarz Version 4 verwendet und mit einer vorhandenen Lösung aus Safranin, Chrysoidin und Diamantfuchsin gegen gefärbt.
Hier das Protokoll:
30.01.2021 (Versuch 1)
- Mehrfaches Spülen der Schnitte mit Ethanol 70% um Formaldehyd und Essigsäure des AFE zu entfernen
Die Schnitte verbleiben als Vorrat unter Ethanol 70% im Uhrglas
Lösung A zugeben und 5 Minuten einwirken lassen (Schnitte gut bedeckt)
Dann ohne Absaugen Lösung B zugeben (12 auf 9 Tropfen - 3 Tropfen weniger als Lösung A, laut Anleitung ist Eisenüberschuss zu vermeiden)
Kernschwarz entsteht sofort als schwarze Wolke
Kurz einwirken lassen. -> ca. 1 Minute unter leichtem Schüttel
- Gründliches Spülen mit Aqua dest.
- Mikroskopkontrolle im Uhrglas unter Aqua dest.:
Die Färbung fällt kräftig aus, verholzte Zellen sind nicht gänzlich farblos. Hier wird sich zeigen, wie gut eventuelle Reste
von der Gegenfärbung verdrängt werden.
Trotz mehrfachen Spülens mit Aqua dest. verbleibt ein gräulicher Schatten im Wasser. Daher die Schnitte mit dem Pinsel in ein frisches Uhrglas mit
Aqua dest. übertragen.
Unter dem Mikroskop zeigt sich anschließend, dass auf dem Wasser im alten Uhrglas unzählige feine, plattenförmige Kristalle schwimmen. Was mag das sein?
Außerdem einige schwarz angefärbte Staubflusen.
- Im neuen Uhrglas nochmals mit Aqua dest. gespült
- Chrysoidin Lösung mit Niederschlag und Safranin nicht vorrätig, daher Gegenfärbung mit Safranin/Diamantfuchsin/Chrysoidin von RDM (fertige Lösung)
- Schnitte zur Färbung gut mit Aqua dest. bedeckt (30 Tropfen). Zugabe von des Safranin/Diamantfuchsin/Chrysoidin Farbgemisches (ebenfalls 30 Tropfen),
Färbung 4 Stunden.
- Nach 4 Stunden Kontrolle unter dem Mikroskop: Farbe zieht nicht auf.
Neuer Färbeansatz mit unverdünnter Lösung. Färbung für ca. 18 Stunden
31.01.2021
- Absaugen der Farblösung und Zugabe von reinem Isopropanol zum Entwässern
Dabei entsteht ein wenig dunkelvioletter Niederschlag - ggf. Reste der Plattenkristalle aus der Kernschwarz-Färbung?
Umsetzen der Schnitte in ein weiteres Uhrglas mit reinem Isopropanol
- Kontrolle unter dem Mikroskop:
Die unverholzten Zellen der Schnitte zeigen eine dunkelviolette Färbung, nicht wie erwartet das dunkelgrau bis schwarz des Kernschwarz
Da hier eine Überfärbung vorliegen könnte (die Schnitte bluten im Wasser-Isopropanol-Gemisch stark), kurzes Differenzieren mit Salzsäure-Alkohol
Es geht viel vom Safranin/Diamantfuchsin/Chrysoidin Farbgemisch ab, das Rotviolett der Sklerenchyme ist nun etwas blass. Die Parenchyme sind wieder
grauschwarz mit einem leichten violetten Einschlag z.B. bei Kollenchymen.
- Entwässern mit reinem Isopropanol (3 * im schnellen Wechsel, 2 * 1 Minute, 2 * 5 Minuten)
- Eindecken in Euparal
Präparate 3805 - 3808 Hedera helix Blattstiel
Präparate 3809 & 3810 Akebia quinata Spross
Prüfung am Eingedeckten Schnitt bestätigt die Kontrolle im Uhrglas. Wichtig: es treten in den Schnitten keine schwarzen Niederschläge auf.
Farbwirkung Efeu:
- Parenchyme grauschwarz (nicht tiefschwarz)
- Kollenchyme dunkelgrauviolett
- disfunktionales Phloem dunkelgrauviolett
- Sklerenchyme und Xylem blassviolett
- Mittellamellen der Sklerenchymzellen violett
- Cuticula kräftig orange (Verblassen möglich?)
Farbwirkung Akebie:
- Parenchyme grauschwarz (nicht tiefschwarz)
- Kollenchyme nv
- Sklerenchyme und Xylem blassviolett, an dickeren Stellen des Schnittes violett
- Mittellamellen der Sklerenchymzellen violett
- Phellem kräftig braunorange (Eigenfärbung - Verblassen zu braun möglich?)
Fazit: das Safranin/Diamantfuchsin/Chrysoidin Farbgemisch ist nicht optimal, zudem war die Färbezeit zu lang.
Die Farbwirkung der frischen und alten Präparate unterscheidet sich (abgesehen von den zu erwartenden Unterschieden bei unterschiedlichen Proben) nicht.
Im Vergleich mit Rolf-Dieters 30µm Schnitten (Präparate 3204 & 3214) scheinen Kernschwarzfärbungen von dünneren Schnitten zu profitieren.
Zur Erklärung mag die Größe des Farbstoffkomplexes dienen: seine "Eindringtiefe" dürfte recht gering sein, was ggf. bei dickeren Schnitten ungefärbte
Innenbereiche der Strukturen hinterlässt.
Und die dazugehörigen Bilder:
Vom Blattstiel des Efeus (Hedera helix):


Und vom Spross der Fingerblättrigen Akebie (Akebia quinata):


Nicht ganz das, was erreicht werden sollte. Auffällig ist, dass die Gegenfärbung auch auf die mit Kernschwarz gefärbten nicht sklerifizierten Zellwände übergreift.
Zwischenzeitlich habe ich die Safranin-Lösung (1%) frisch angesetzt und die Chrysoidin-Lösung (auch 1%) gefiltert. Gong zur zweiten Runde!
Zunächst das Protokoll:
04.02.2021 (Versuch 2 - Kernschwarz Hamburg, Safranin, Chrysoidin)
- Überführen von einigen Schnitten in ein weiteres Uhrglas
- Stufenweises überführen in Aqua dest.
- Färbung mit Kernschwarz (Hamburg Rezept 4 ohne Gummi Arabicum) nach Bobs Anleitung
- Lösung A pur für 5 Minuten unter leichtem Schütteln, Schnitte gut bedeckt
- Abpipettieren
- 2 * Spülen mit Aqua dest.
- 10 Tropfen Wasser, ein Tropfen Lösung B, schnell vermischen, für 1-2 Minuten unter leichtem Schüttel
Schnitte färben sich etwas unregelmäßig schwarzgrau. Besonders der dünnste Hedera Schnitt bleibt blass.
- Gründliches Spülen mit Aqua dest.
- Zweite Färbung mit Safranin
90 Minuten in stark verdünnter Safranin-Lösung: 1 Tropfen einer 1%igen Safranin-Stammlösung in 100 cm³ Wasser (!).
In dieser Verdünnung wurde keinerlei Safranin angenommen (Mikroskopkontrolle)
Erneut für 90 Minuten mit ca. einem Tropfen in 10 ml Aqua dest.
- Gründliches Spülen mit Aqua dest.
- Dritte Färbung Chrysoidin
270 Minuten in verdünnter Chrysoidin-Lösung: 1%ige Chrysoidin-Stammlösung 1:10 mit Wasser verdünnt.
- Gründliches Spülen mit Aqua dest.
- Entwässern mit reinem Isopropanol (3 * im schnellen Wechsel, 2 * 1 Minute, 2 * 5 Minuten)
- Eindecken in Euparal
Präparate 3811 - 3814 Hedera helix Blattstiel
Präparate 3815 & 3816 Akebia quinata Spross
Farbwirkung Efeu, deutlicher Unterschied bei dünnerem Schnitt (3812) in Klammern:
- Parenchyme grauviolett (hellviolett)
- Kollenchyme dunkelgrauviolett (violett)
- Phloem schwarzgrauviolett (violett, teils leicht braun)
- disfunktionales Phloem dunkelgrauviolett (violett)
- Sklerenchyme und Xylem orange (leuchtend orange)
- Mittellamellen der Sklerenchymzellen rotorange (rotorange)
- Cuticula kräftig orange (kräftig orange) - Verblassen möglich?
Farbwirkung Akebie:
- Parenchyme grauviolett bis violett
- Kollenchyme nv
- Sklerenchyme und Xylem orange, an dickeren Stellen des Schnittes dunkelorange
- Mittellamellen der Sklerenchymzellen rotorange
- Phellem kräftig braunorange (Eigenfärbung - Verblassen zu braun möglich?)
Fazit: Die Färbung ist im Vergleich zu den Ambrosia artemisiifolia Präparaten von RDM (3204 & 3214) gründlich misslungen
Die Farbwirkung der frischen und alten Präparate unterscheidet sich (abgesehen von den zu erwartenden Unterschieden bei unterschiedlichen Proben)
auch hier nicht.
Und die Bilder:
Vom Blattstiel des Efeus (Hedera helix):

Und vom Spross der Fingerblättrigen Akebie (Akebia quinata):

Nun, was soll man sagen: selten ist eine Färbung so schief gegangen.
Aber ich habe noch ein Fläschchen mit dem Kernschwarz von Chroma! Also noch mal ran, wieder mit Safranin und Chrysoidin als Gegenfärbung:
Das Protokoll:
07.02.2021 (Versuch 3 - Kernschwarz Chroma, Safranin, Chrysoidin)
- Überführen von einigen Schnitten in ein weiteres Uhrglas
- Stufenweises überführen in Aqua dest.
- Färbung mit Kernschwarz (Chroma) für 120 min 1:5 in Aqua dest verdünnt (10 Tropfen zu 2 Tropfen)
- Gründliches Spülen mit Aqua dest.
- Zweite Färbung mit Safranin
90 Minuten in stark verdünnter Safranin-Lösung: 1 Tropfen einer 1%igen Safranin-Stammlösung in 100 cm³ Wasser (!).
Diesmal wurde das Safranin gut angenommen und färbt nur sklerenchymatische Zellwände. (Mikroskopkontrolle)
- Gründliches Spülen mit Aqua dest.
- Dritte Färbung Chrysoidin
270 Minuten in verdünnter Chrysoidin-Lösung: 1%ige Chrysoidin-Stammlösung 1:10 mit Wasser verdünnt (1 Tropfen Chrysoidin Lösung auf 10 Tropfen Aqua dest.).
- Gründliches Spülen mit Aqua dest.
- Entwässern mit reinem Isopropanol (3 * im schnellen Wechsel, 2 * 1 Minute, 2 * 5 Minuten)
- Eindecken in Euparal
Präparate 3817 - 3820 Hedera helix Blattstiel
Präparate 3821 & 3822 Akebia quinata Spross
Farbwirkung Efeu:
- Parenchyme grau bis grauschwarz
- Kollenchyme grauschwarz (in einem dünneren Schnitt hellgrau)
- Phloem grauschwarz
- disfunktionales Phloem dunkelgrauschwarz
- Sklerenchyme und Xylem leuchtend orange
- Mittellamellen der Sklerenchymzellen rotorange
- Cuticula kräftig orange (kräftig orange) - Verblassen möglich?
Farbwirkung Akebie:
- Parenchyme grauschwarz
- Kollenchyme nv
- Sklerenchyme und Xylem orange, an dickeren Stellen des Schnittes dunkelorange
- Mittellamellen der Sklerenchymzellen orange bis orangebraun
- Phellem kräftig braunorange (Eigenfärbung - Verblassen zu braun möglich?)
Fazit: Die Färbung ist im Vergleich zu den Ambrosia artemisiifolia Präparaten von RDM (3204 & 3214) fast ebenbürtig.
Die Farbwirkung der frischen und alten Präparate unterscheidet sich (abgesehen von den zu erwartenden Unterschieden bei unterschiedlichen Proben)
auch hier nicht.
Und die zugehörigen Bilder, diesmal nur vom Efeu aber nach jedem einzelnen Schritt, die ersten beiden Aufnahmen mit Aqua dest. im Uhrglas:
Nach der Kernschwarz-Färbung (Chroma)

Jetzt mit Safranin

Und nun die komplette Färbung, frisch eingedeckt unter Euparal:


Das kommt dem Ziel, das Rolf-Dieter vor zwei Jahren vorgegeben hat, doch schon recht nahe:
Spross von Ambrosia artemisiifolia nach gleichem Protokoll wie mein Versuch 3:

Irgendetwas macht Chroma mit seiner Eintopf-Lösung richtig, was sich uns noch nicht erschlossen hat.
Ggf. spielt auch der pH-Wert eine Rolle: Safranin ist ja eher sauer, Chysoidin basisch ... (Danke für den Hinweis an Walter Nänny).
Herzliche Grüße
Jörg