Versuche rund um Kernschwarz

[jako_66]

Hallo Jochen,

interessante Frage mit dem Thymol! Für einen 250 ml Ansatz nehme ich ca. 3-5 mg Thymol, filtriere aber immer hinterher. Wenn ich Thymol in Wasser löse und Eisen(III)chlorid dazugebe, passiert erst einmal nichts. Es wird eher die hell-orangerote Färbung vom Eisen(III)chlorid komplett farblos. Nach etwa 5-6 h ergibt sich eine helle gold-gelbe Färbung...
Dies dürfte aber nicht zur Schwarzfärbung beitragen, dazu ist es zu wenig Thymol.

Denke FeCl₃ x x H₂O kann man gut nehmen. Für die 2-Komponenten Ansätze dürften +/- 30% ok sein.

Selbst werde ich mit der Version 2 & 6 weitermachen, parallel dazu den alkalischen Ansatz nach Mayer wieder aufnehmen. Wer mag wird herzlich in die Runde der frustrationstoleranten ß-Tester aufgenommen! Päckchem mit den beiden Pipettenflaschen geht gegen Übernahme der Portokosten raus.

Viele Grüße

Sven

[Bob]

Hallo Maria,
Salzsäure 24% bekommt man auch in Baumärkten und bei Baustoffhändlern, wird zum Entfernen von Zementschleiern verwendet. Fuchsin ist ein regressiver Farbstoff, der färbt zunächst alles, wie Bolognese-Sauce. Er wird erst selektiv durch das differenzieren. 70% Ethanol hat da wenig bis gar nichts bewirkt. Probiere es ruhig mal mit der Essigsäure. Mit meiner Mischung bekam ich das Fuchsin komplett aus den nucht verholzten Bereichen raus. Diese rigide Behandlung entfernt die meisten Farbstoff ruck-zuck und vollständig, deshalb muss die Fuchsin-Färbung und -Differenzierung am Anfang stehen.

Zur Färbung durch Thymol:
Bei meiner Reihenfolge, also mit Gegenfärbung vorweg, ist das Thymol wohl weitgehend ausgewaschen, bevor Eisen dazu kommt. Färbt man anders herum verbleibt ja Eisen im Schnitt und man gibt hinterher thymolhaltige Lösungen dazu. Komplett ausschließen würde ich den Effekt als nicht aus der Betrachtung, er stellt aber m.E. hicht das Hauptproblem dar.

@Alle: Wie hat Euch eigentlich die Schwarz-Färbung alleine gefallen? Je nach Schnitt und Schnittdicke finde ich sie recht ansehlich, so eine Art 50er Jahre Reportage-Look.

Viele Grüße,

Bob

[M Beier]

Hallo an alle,
der Reiz von Rolf-Dieters Schnitten war ja, dass sie sehr dünn waren und dadurch der Effekt der Tuschezeichnung entstand. Bei mit sind meist noch Reste des Zellinhalts und Querwände da, so dass das Grau deutlich überwiegt. Das trübt den Eindruck doch etwas.
Mit Chlorix ist es nicht deutlich besser geworden. Da muss ich noch mal anderes Material ausprobieren, aber im Moment ist alles unter Schnee verschwunden .

@ Bob: Das mit der Salzsäure und den Baumärkten ist schon klar. So weit ich mich erinnere standen da aber Literflaschen rum und so viel wollte ich ich hier zu Hause nicht haben. Irgend wann werde ich in der Schule auch wieder um ein kleines Fläschchen bitten können. Erst  mal teste ich die Essigsäure.
Gruß Maria

[M Beier]

Liebe Tester,
jetzt habe ich die umgekehrte Reihenfolge bei der Färbung ausgetestet, also erst Chrysoidin/Safranin mit anschließender Differenzierung und dann Kernschwarz. Das hat deutlich besser funktioniert.
Schnitte: Wieder Schnitte von Efeublattstielen in AFE fixiert und dann Alkoholreihe in Wasser
Färbeschritte:
Verdünnung der Lösungen 1% Safranin und 1% Chrysoidin: jeweils 1 Tropfen in 20 Tropfen Wasser --> Farbe A
Dann habe ich nochmals 1:10 verdünnt --> Farbe B
In beiden Farblösungen habe ich die Schnitte 5 Stunden bei Raumtemperatur belassen. Alle Schnitte waren insgesamt deutlich orange/rot gefärbt, die Schnitte aus Farbe A  intensiver. 
Zur Diffenrenzierung habe ich 70% Ethanol mit einem Tropfen 25% Essigsäure verwendet. Bei den Schnitten aus Farbe B war schon nach kurzer Zeit mit bloßem Auge kaum noch eine Färbung zu erkennen, aber Xylem und Rindenparenchym waren noch deutlich gelb. Im  Mark war keine Farbe mehr erkennbar.
Bei den Schnitten aus Farbe A ließ sich die Farbe im Markbereich schlecht entfernen. Die Schnitte hatten nach der Kernschwarzfärbung einen violetten Farbstich.

Färbung Kernschwarz: 5 min Lsg A(V6 von Sven), kurz waschen und wenige Sekunden in Lsg B 1:10 verdünnt.
Die Färbungen aus der zweimal verdünnten Safranin/Chrysoidin Lösung waren nach der Kernschwarzfärbung sauber grau/schwarz und gelb.

Bei den Fotos hatte ich Probleme mit den Weißabgleich, die grauen Bereich hatten einen deutlichen Blaustich, speziell beim 10er Objektiv. Ich habe dann in Lightroom die Farben möglichst wieder so angepasst, dass sie dem Blick durchs Mikroskop entsprachen.(Da muss die Fehlerursachen noch suchen

Bild 1 Färbung mit der zweifach verdünnten Safranin/Chrysoidin Lsg nach der Differenzierung, ohne Kernschwarz


Bild 2 Färbung mit der einfach verdünnten Safranin/Chrysoidin Lsg.  mit Kernschwarz, hier war die Differenzierung nicht vollständig und das Schwarz hat einen Farbstich


Bild 3 wie Bild 1 10er Objektiv


Bild 4 Bei dünneren Schnitten sieht es noch etwas besser aus


Ich wollte jetzt nochmal Schnitte nur mit Chrysoidin und Kernschwarz testen. Mal schauen, ob sich die Ergebnisse stabilisieren.
(Na und den Fehler beim Weißabgleich suchen)
Viele Grüße
Maria

[M Beier]

Bild 2 ist nicht angekommen

[Bob]

Hallo Maria,
das sieht doch schon richtig gut aus, besonders die Bilder 3 und 4! Es kommt mir dabei so vor, als das Chryosidin bei Dir besser zur geltung kommt, als bei meinen Versuchen. Bei Deinem Bild 3 habe ich den Weißabgleich mit GIMP nochmal geändert (Klick auf Hintergrund =>Du bist jetzt weiß), das reduziert den verbleibenden Farbstich im Schnitt auch.

Selbst habe ich gestern versucht, einen 10µ-Paraffinschnitt zu schwärzen, und das war eine zähe Angelegenheit, der Schnitt nahm nur ungern Farbe an. Da er gut klebte habe ich erst Svens Variante 2 mit APS, dann noch mal V3 angewended. Er nahm dann schon Farbe an, aber nicht so überzeugend. Bei fixiertem Frischmaterial, 40-50µ, bekomme ich eigentlich immer sofort eine kräftige, selektive schwarze Färbung. Wo mag da der Unterschied sein? Schnittdicke? Paraffinierung?

Interessant immerhin: Ich habe eine Nesselzelle genau mittig getroffen!

Viele Grüße,

Bob

[M Beier]

Hallo Bob,
mit Paraffineinbettung habe ich gar keine Erfahrung und kann also dazu nix sagen.
Aus meiner Sicht scheint es besser zu sein, das Kernschwarz erst im zweiten Schritt anzuwenden. Ich werde jetzt versuchen mit den Safranin und Chrysoidin zusammen oder getrennt erst mal eine saubere Färbung hin zu bekommen und dann Kernschwarz drauf.
Gruß Maria

[M Beier]

Hallo Bob,
das mit dem Brennsesselhaar ist ist natürlich toll. Schon bei der Ebene muss man ja total Glück haben und dann bleibt es auch noch intakt.
Gruß Maria

[Fahrenheit]

Liebe Tester,

hier haben sich ja mittlerweile einige Versuchsserien gesammelt! Es bleibt interessant.

Heute habe ich meine Schnitte aus meiner Versuchsreihe 3 (Kernschwarz Chroma / Chrysoidin / Safranin) eingedeckt. Sie lagen 7 Tage auf der Wärmeplatte.
Hier ein Vergleich direkt nach dem Eindecken und 7 Tage später:

Frisch eingedeckt:


Nach 7 Tagen auf der Wärmeplatte:


Man sieht: die Chrysoidin / Safranin Gegenfärbung ist schon deutlich verblichen. Ich bin gespannt, wie lange sie hält.
Vor allem frage ich mich, was Rolf-Dieter anders gemacht hat (ich habe an sich genau nach seinem Rezept gearbeitet ...). Seine Präparate sind auch nach zwei Jahren noch schön "frisch".

Herzliche Grüße
Jörg

[jako_66]

Hallo zusammen,

mittlerweile ist bei diesem nicht so einfachen Thema ja viel Bewegung!

Nachfolgend die Ergebnisse gestriger Färbeversuche an Paraffinschnitten (um die 10 µm geschnitten vom Meister, also nicht von mir...). Die ersten 2 Bilder zeigen den 2-Komponenten Ansatz mit Kernschwarz (2 min Lösung A, darauf 15-20 s Lösung B). Das dritte Bild zeigt einen Querschnitt durch ein Mangroven-Blatt mit dem Feststoff nach Mayer 1%ig in Wasser 2-3 min bei 45 °C gefärbt.

Für längere Färbezeiten war es schon zu spät.
- Safranin 5 min bei 45°C, Differenzierung mit 0.75% Salzsäure-Ethanol
- Chrysoidin 30 min bei 42 °C, Differenzierung mit 70% Ethanol
- dann die Kernschwarz-Färbungen

Den Versuch mit dem aufgelösten Feststoff wiederhole ich mit längerer Einwirkzeit auch an Paraffinschnitten, die ohne Eiweißglycerin aufgeklebt wurden.

Viele Grüße

Sven

[Bob]

Hallo Sven,
gerade bei Deinem ersten Bild hat sich das Schwarz ja sehr deutlich angelagert, das hat bei meinem Versuch am Paraffinschnitt nicht geklappt. Ich hatte auf 10µ geschnitten und Du?

Hier noch ein Versuch am Freihandschnitt vom Rhododendrontrieb:

Safranin 0,1 % 5 Minuten (zu lang)
Differenziert aus allen Rohren feuernd, Safranin nicht ganz zurückgedrängt bekommen
Sven 3A pur für 3 Minuten
2x Waschen mit dem. Wasser
Sven 4B 10% für 20 Sekunden

Das Ergebnis gefällt mir ganz gut!

Viele Grüße,

Bob

[M Beier]

Hallo Bob,
das Safranin färbt sehr intensiv und ich habe es auf 0,01% verdünnt. Dann ließ es sich auch ganz gut differenzieren.
Ist das Blau im Rindenparenchym  tatsächlich im mikroskopischen Bild oder ist es eine chromatische Abreration? Bei mir färbt Saranin eindeutig rot.
Ich habe auch noch mal gefärbt, Chrysoidin und Safranin getrennt. Die Schnitt sind jetzt fest und ich kann sie fotografieren.
Als bis die Tage.b
Gruß Maria

[Bob]

Hallo Maria,
das hätten wirklich gut chromatische Abberationen sein können, sind es aber wohl nicht: Ich habe nochmal mit einem 10er Planapo und achromatisch-aplanatischem Kondensor ein Foto gemacht. Da sind die Farben ungefähr genau so. Ich vermute, dass der blau-violette Farbton vom Überfärben und stark Differenzieren kommt, und so nicht auftreten würde, wenn man direkt nur maßvoll färben würde. Aber hübsch ist die Kombination rot+blauviolett...

Viele Grüße,

Bob

[M Beier]

Liebe Kernschwarz-Tester,
inzwischen  ist eine neue Reihe fertig. Diesmal habe ich die Blattstiele vom Goldtüpfelfarn verwendet, der sich im Treppenhaus sehr wohlfühlt.
Ich habe als Vorfärbung Safranin und Chrysoidin getrennt getestet. Die Farblösungen sind stark verdünnt.
Schritt 1: 20 Tropfen Wasser und ein Tropfen 1% ige Lösung
Schritt 2: 10 Tropfen Wasser und ein Tropfen Lösung 1
Färbedauer: Ca 5 Std bei Raumtemperatur

Bild 1

Differenziert habe ich mit Ethanol und etwas Essigsäure
Mein Eindruck war, dass sich die verdünnten Lösungen (Schritt 2) leichter und sauberer differenzieren ließen.
Färbung mit Kernschwarz: ca 5 min Lösung A(v6) von Sven, danach kurz waschen und einige Sekunden in Lsg. B (Verdünnt 1:10),
dann wie üblich in Euparal eindecken.
Die Bilder 2-4 sind mit Safranin gefärbt, die Bilder 5-7 mit Chrysoidin.

Bild2


Bild3


Bild 4


Bild 5


Bild 6


Bild 7

Zum Vergleich habe ich noch 3 Bilder mit Färbungen mit sowie WIII sim 2 ( Bild 8 und 9) sowie Etzold  Bild 10 , die ich schon früher mal gemacht habe, angehängt.




Bild 8


Bild 9


Bild 10

Da mein Eindruck ist, dass Safranin stärker färbt, wird der nächste Versuch mit sehr verdünnter Safranin-Lsg (Schritt 2) und der verdünnten Chrysoidin-LSG (Schritt 1) laufen.
Es wird aber noch etwas dauern, da bei diesem Wetter erst mal die Apfelbäume bei uns in der Gemarkung geschnitten werden.


@Jörg: Ob die Farben schwächer werden konnte ich bis jetzt nicht beobachten. Also mal abwarten

Viele Grüße
Maria

[jako_66]

Hallo zusammen,

hatte am Wochenende noch einmal die Kernschwarz-Färbung versucht. Bis auf den Tipp von Gerhard mit der Verwendung von Ostermayers Waffenfett am Jung HN-40 wurde nicht viel geändert. Außer dass ich auf das Eiweißglycerin verzichtet habe.

Etwas entäuscht hat die Verwendung von anderen schwarzen Farbstoffen wie Nigrosin, Amidoschwarz 10 B oder Chlorazolschwarz. Auch der Kernschwarz-Feststoff nach Mayer färbte unter den Bedingungen schlecht, bzw. gar nicht. Die Idee war den Chroma-Farbstoff nachzubauen, was ich nun aufgebe.

Safranin O färbte anfangs ganz gut, ist aber im Verlaufe der Prozedur bei einigen Proben verschütt gegangen.

Die 2-Komponten Kernschwarz-Färbung (v6, ist aber egal, welche Version man nimmt) wurde immer erst am Ende durchgeführt:
3-4 Tropfen Wasser vorlegen, 1 Tropfen der Tannin-Gallussäure zugeben, kurz hin- und herbewegen, dann 1 Tropfen einer 2%igen Eisen(III)chlorid-Lösung draufgeben und sofort schräg abfließen lassen, mit Wasser gut nachspülen.

Alle Paraffinschnitte eines Brenn-Nessel-Stengels mit 20 µm, Objektträger vorher mit Aceton, dann Cyclohexan gereinigt, ausgeglüht und mit nur 40% Abschwimmrate im letzten Wasserbad gerade noch akzeptabel.

Die Aufnahmen sind ungestackt und für das Forum erheblich verkleinert. Vielleicht sollte man einmal eine Schnittdicke von unter 10 µm probieren, da gerade das Kernschwarz die "Tuschezeichnung" erst bei sehr dünnen Schnitten schön zeigt.

Viele Grüße

Sven