Autor Thema: Weitere Versuche mit Fluoreszenz - jetzt UV  (Gelesen 1119 mal)

witweb

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Weitere Versuche mit Fluoreszenz - jetzt UV
« am: April 19, 2021, 17:55:00 Nachmittag »
Hallo,

nun habe ich das Equipment komplett, um auch im UV-Bereich Fluoreszenz-Versuche durchführen zu können. Über meine Experimente mit Blauanregung hatte ich ja schon berichtet (Erste Versuche mit Fluoreszenz (Blauanregung).
Der UV-LED-Einsatz für den Zeiss Fluoreszenz-Auflichtkondensor an meinem Standard 18 stammt wieder von Stephan Hiller und basiert auf einer Nichia NVSU233B mit 365 nm.

Eine Herausforderung ist, mit den Gefahren, die sich durch den Umgang mit UV-Licht ergeben, möglichst stressfrei umgehen zu können. Wir hatten das Thema ja schon an anderer Stelle diskutiert. Ursprünglich wollte ich Plexiglasstücke so an bringen, dass kein Streulicht oder Reflexionen ins Auge gelangen kann. Das erschien mir aber recht aufwendig, da der Auflichtkondensor IV FL doch aus allen Ritzen strahlt. Dazu dann das Licht, das vom Objektträger reflektiert wird. Also habe ich wieder meine UV-Schutzbrille aufgesetzt, die aber mit meiner Computerbrille nicht kooperieren wollte. Jetzt habe ich eine spezielle Überbrille gefunden, die sowohl der DIN EN 166 wie auch der DIN EN 170 entspricht und perfekt über meine Computerbrille passt.
Falls Interesse, das Teil heißt Uvex Super F OTG Schutzbrille. Die Brille findet man schnell bei allen möglichen Händlern. Trotzdem werde ich noch ein paar Abschirmungsmaßnahmen treffen.

Nun zu den ersten Versuchen:
Ich habe mal mit Micromounts angefangen, weil ich die noch von vorherigen Aufnahmen liegen hatte.
Bild 1: Rubin, wobei auch das umgebende Mineral schön fluoresziert. Kann ich aber nicht sicher zuordnen. Bildbreite=3,2 mm
Bild 2: Nadelige Kristalle von Aragonit. Bildbreite=1,75 mm
Bild 3: Autofluoreszenz von Moosblättern. Bildbreite=1,1 mm
Bild 4: Moosblätter, gefärbt mit Acridinorange. Soweit ich weiß, wird AO eher für Anregungswellenlängen um 500 nm eingesetzt wird. Also nicht für 365 nm. Aber für einen ersten Versuch sollte das mal gehen. Bildbreite=1,1mm

Fortsetzung folgt!

Beste Grüße

Michael

Rawfoto

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Re: Weitere Versuche mit Fluoreszenz - jetzt UV
« Antwort #1 am: April 19, 2021, 18:54:06 Nachmittag »
Hallo Michael

Das Bild des Moosblättchen finde ich richtig gut. Ist das Autofluoreszenz oder ein gefärbtes Präparat, das Rot geht ja in diese Richtung, aber die anderen Farben ...

Einfach spannend 🧐

Liebe Grüße

Gerhard
Gerhard
http://www.naturfoto-zimmert.at

Rückmeldung sind willkommen, ich bin jederzeit an Weiterentwicklung interessiert, Vorschläge zur Verbesserungen und Varianten meiner eingestellten Bilder sind daher keinerlei Problem für mich ...

witweb

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Re: Weitere Versuche mit Fluoreszenz - jetzt UV
« Antwort #2 am: April 20, 2021, 12:28:02 Nachmittag »
Hallo Gerhard,

das erste Bild der Moosblättchen zeigt Autofluoreszenz, das zweite ist gefärbt. Ich habe dazu Acridinorange verwendet (10µg/ml), 30 min gefärbt, dann mit Wasser gespült. Allerdings habe ich so gut wie keine Erfahrung mit Färbungen, es ist also einfach nur ein Versuch, zumal Acridinorange wohl nicht für UV vorgesehen ist. Allerdings sind, speziell für Färbungen für Fluoreszenz auch nicht so viel Infos zu finden. Im Forum mal hier und dort etwas, aber ansonsten sehe ich nur reichlich Informationen für Profis, die sich mit meinen Amateurmitteln kaum realisieren lassen. Andererseits will ich ja keine Wissenschaft betreiben. Ganz informativ ist allerdings die Übersicht auf der Seite der http://www.mikrohamburg.de/, unter Goodies.
Mit Fluorescein und Wacker ASim III werde ich dann weitere Versuche machen.

Liebe Grüße

Michael

Bild von dem Moos, das mir die Blättchen zur Verfügung stellt.  :)

« Letzte Änderung: April 20, 2021, 13:20:37 Nachmittag von witweb »

bernd552

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Re: Weitere Versuche mit Fluoreszenz - jetzt UV
« Antwort #3 am: April 21, 2021, 12:37:50 Nachmittag »
Hallo Michael,

das 4. Bild könntest du für die neuen Avatar-Fortsezungen einreichen, dann aber in 3D ;)

LG
Bernd

witweb

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Re: Weitere Versuche mit Fluoreszenz - jetzt UV
« Antwort #4 am: April 21, 2021, 16:59:54 Nachmittag »
Hallo Bernd,
mache ich doch sofort. Falls mal die Anfrage kommt...
LG
Michael

witweb

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Re: Weitere Versuche mit Fluoreszenz - jetzt UV
« Antwort #5 am: April 24, 2021, 17:55:57 Nachmittag »
Hallo zusammen,

ich merke immer mehr, dass das Fotografieren bei Fluoreszenz doch etwas anderes ist, als ich das, was ich sonst gewöhnt bin. Generell stacke ich die meisten Aufnahmen, nur gelegentlich mache ich Schnappschüsse zu Testzwecken oder für mich zur Dokumentation.
Das Hauptproblem ist die, oft vergleichsweise geringe, Lichtausbeute. Das hängt natürlich sehr vom Objekt ab, aber auch von den Fluorochromen, wenn welche zum Einsatz kommen. Natürlich auch vom verwendeten Objektiv.
Ich stacke mit der EOS 750D und steure diese über Helicon Remote. Dort gibt es in den Grundeinstellungen einen Punkt „Live View Helligkeit erhöhen“. Das geht bis +5EV! Das Live-View-Bild ist dann ordentlich verrauscht, aber immer noch besser als nix!
Die Belichtungszeiten der Aufnahmen, die ich in den letzten Tagen gemacht habe, lagen zwischen 1/20 s (Einsatz von Fluoreszenzfarbstoff) und 6 s bei schwach leuchtenden Kristallen, die ISO-Werte zwischen 100 und 800. Da spielt das Fremdlicht eine entscheidende Rolle, auch von den Bildschirmen in der Nähe. Ich mache bei gedämpftem Licht im Raum immer zuerst eine Probeaufnahme, dabei ist das Auflicht vom Mikroskop ausgeschaltet. Im Idealfall ist das Bild völlig schwarz. Was dann noch „unter der Grasnarbe“ aufgenommen wird, kann man wohl ignorieren. Unter Umständen muss man das Fremdlicht gezielt abschirmen.
Speziell bei Micromounts stellt sich das Problem, für das Stacken den Start- und Endpunkt richtig festzulegen. Nach einigen Versuchen und Tappen im Dunkeln, habe ich mich dann entschlossen, eine meiner guten alten Schwedenfackeln wieder herauszuholen und nutze diese nun als Einstell-Licht. Geht super. Aber auch nur als Orientierung, denn das Leuchten kommt ja oft von anderen Stellen, als von denen, die man gut im sichtbaren Bereich erkennt.
Da wird schnell ein kleiner Bereich, am Rand oder eine Vertiefung im Objekt, übersehen, der dann im Nachhinein unscharf ist.
Fotografiert wird in RAW. Das mache ich generell so, nicht nur bei Fluoreszenz. Aber hier sind die Anforderungen an die Nachbearbeitung u. U. deutlich höher, als bei „normalen Aufnahmen“. Das geht vernünftig nur mit RAW!

Ein weiteres Problem sind Staub und Fusseln jeder Art. Die sind ja immer beim Mikrospieren ein Problem, aber bei Blauanregung oder UV leuchten diese zum Teil um Größenordnungen heller, als das eigentliche Objekt. Könnte man eigentlich auch als Einstell-Licht nutzen (Späßle!).
Dann sind da noch die Objektive, die nur zum Teil für UV-Licht geeignet sind...

Fluoreszierende Grüße

Michael

Hier noch zwei Bilder von Moosblättchen, gefärbt mit WASim III.
WASim III ist für diese Art von Präparaten sicher nicht besonders sinnvoll. Aber es geht ja um Versuche und Erfahrungen sammeln.
Weiß jemand, welches Moos das ist? Eventuell Ufermoos?

Bild 1: Bildbreite= 1,75 mm   
Bild 2: Bildbreite= 0,27 mm


« Letzte Änderung: April 24, 2021, 18:00:22 Nachmittag von witweb »

Adalbert

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Re: Weitere Versuche mit Fluoreszenz - jetzt UV
« Antwort #6 am: April 24, 2021, 19:11:25 Nachmittag »
Hallo Michael,
tolle Fotos und wertvolle Beobachtungen!
Danke und Gruß,
ADi

witweb

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Re: Weitere Versuche mit Fluoreszenz - jetzt UV
« Antwort #7 am: April 25, 2021, 18:25:56 Nachmittag »
Danke ADi für dein Lob!

Hier noch ein Bild von Hefezellen. Das ist Frischhefe aus dem Kühlregal, gefärbt mit Acridinorange. Bildbreite 0,15 mm, Einzelbild.
Ich vermute, dass die grünen Zellen leben, während die orangefarbenen abgestorben sind. Bin mir aber mit dieser Interpretation nicht sicher.

Grüße

Michael
« Letzte Änderung: April 25, 2021, 18:28:13 Nachmittag von witweb »

witweb

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Re: Weitere Versuche mit Fluoreszenz - jetzt UV
« Antwort #8 am: April 28, 2021, 18:29:28 Nachmittag »
Noch ein bisschen Hefe...

Das  erste Bild ist aus dem vorherigen Präparat entstanden, nachdem es über Nacht eingetrocknet ist.
Die nächsten beiden Aufnahmen zeigen ebenfalls die Hefezellen, gefärbt mit "Optical Brightener". Das zweite Bild wieder eingetrocknet.
Bildbreite ca. 0,15 mm, nicht gestackt.

Viel Spaß beim Anschauen!

Michael

witweb

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Re: Weitere Versuche mit Fluoreszenz - jetzt UV
« Antwort #9 am: April 29, 2021, 19:28:56 Nachmittag »
...und noch eine Detailaufnahme von meinem Moospölsterchen. Ich weiß jetzt immer noch nicht, wie das Moos heißt.
Bildbreite 0,3 mm, gefärbt mit Optical Brightener.

Viele Grüße

Michael

Carsten Wieczorrek

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Re: Weitere Versuche mit Fluoreszenz - jetzt UV
« Antwort #10 am: April 29, 2021, 20:30:37 Nachmittag »
Hallo Michael,
in welcher Konzentration hast Du den denn eingesetzt? Eigentlich sollte der keine Pflanzenzellen färben. Oder gehört das Objekt gar nicht zum Moos und steckt da nur drin? Oder ist das Moos schon verpilzt?  ;D

Carsten
« Letzte Änderung: April 30, 2021, 10:57:46 Vormittag von Carsten Wieczorrek »
Für's grobe : CZJ GSZ 1
Zum Durchsehen : CZJ Amplival Hellfeld, Dunkelfeld, INKO
Zum Draufsehen : CZJ Vertival Hellfeld, Dunkelfeld
Zum Drauf- und Durchsehen: CZJ Epival Hellfeld
Für psychedelische Farben : CZJ Fluoval 2 Auflichtfluoreszenz
Für farbige Streifen : CZJ Epival Interphako

A. Büschlen

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Re: Weitere Versuche mit Fluoreszenz - jetzt UV
« Antwort #11 am: April 29, 2021, 21:35:43 Nachmittag »
Hallo Michael,

der Einwand
Zitat
Oder gehört das Objekt gar nicht zum Moos und steckt da nur drin? Oder ist das Moos schone verpilzt?
von Carsten ist berechtigt.

Kannst du das Objekt ohne Färbung und Fluoreszenz zeigen?

Gruss Arnold

Soki

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Re: Weitere Versuche mit Fluoreszenz - jetzt UV
« Antwort #12 am: April 30, 2021, 08:22:30 Vormittag »
Hallo Michael,

ganz hervorragende Bilder in technisch und handwerklich höchster Qualität. Die Bilder würde sich sicher toll an der Wand machen!

Grüße,
Simon 

Flagellate

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Re: Weitere Versuche mit Fluoreszenz - jetzt UV
« Antwort #13 am: April 30, 2021, 10:54:54 Vormittag »

ich merke immer mehr, dass das Fotografieren bei Fluoreszenz doch etwas anderes ist, als ich das, was ich sonst gewöhnt bin. Generell stacke ich die meisten Aufnahmen, nur gelegentlich mache ich Schnappschüsse zu Testzwecken oder für mich zur Dokumentation.

Ja, Fluoreszenz-Bilder sind was ganz anderes, was die Herausforderung angeht.

In der Forschung kommt nicht umsonst spezielle Ausrüstung zum Einsatz.

Was das Stacken angeht, wird ein z-Stack über eine motorisierte Steuereung angelegt. So ein Stack braucht, je nach Einstellung locker mal 6-10 Minuten.
Die verwendeten Kameras sind üblicherweise extra auf Fluoreszenz-Signale abgestimmt.
Idealerweise werden Laser eingesetzt, die durch klar definierte Wellenlängen das Maximum aus dem FL-Signal holen.

Im Hobby-Bereich ist dies kaum umsetzbar, da die Anschaffungskosten ernorm sind und auch die laufenden Kosten. Die Laser müssen regelmäßig ausgetauscht werden und da reden wir über mehrere Tausent Euro....

Optimieren könntest du deine Bilder durch den Einsatz von Fluoreszenz optimierten Objektiven (bei Zeiss Neofluar) und durch den Einsatz eines besseren Bild-Sensors (Vollformat).
Viel mehr kannst du nicht machen, sofern du bereits das reine FL-Signal durch optimale Filter hast. Ansonsten höchsten noch "bessere" Filter nutzen, welche den Wellenlängen-Bereich deines Signals besser definieren.

Ich kann mich dem Rest aber nur anschließen. Die gezeigten Bilder sind qualitativ sehr gut und könntent ohne Probleme in einer Fachpublikation veröffentlicht werden  ;)

Grüße,
Tobias

witweb

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Re: Weitere Versuche mit Fluoreszenz - jetzt UV
« Antwort #14 am: April 30, 2021, 11:36:51 Vormittag »
Hallo Carsten, Arnold, Simon und Tobias

zunächst vielen Dank für die positiven und interessanten Rückmeldungen!

@ Tobias – Danke für die Infos! Zum Thema Aufnahmetechnik und Objektive schreibe ich nochmal etwas in einem extra Beitrag.

@ Carsten – Das Objekt gehört schon zum Moos, siehe Bild unten, das einen Ausschnitt aus einem früheren Bild zeigt (allerdings mit Acridinorange gefärbt).
Ich habe meine Versuchen mit dem Optical Brightener aus dem „Fluorescent Dye Starter Kit“ zunächst mit Hefe begonnen, da du an anderer Stelle mal angemerkt hattest, dass sich der Optical Brightener sehr gut zur Markierung von Pilzzellen eignet. Und Hefe war gerade greifbar...
Dazu habe ich 100µl aus dem Fläschchen des Sets mit 9,9ml Wasser verdünnt. Davon habe ich dann 2 Tropfen zu der Hefesuspension gegeben.

Für das Moos-Foto habe ich ein Stängelchen (ca. 4 mm) auf einer Tüpfelplatte gefärbt, wobei das Verhältnis Wasser zu o.g. Verdünnung etwa 5:1 betrug. Dann gespült.
Das war das Ergebnis einer Reihe von Versuchen, wobei ich zunächst andere Konzentrationen getestet habe.

@ Arnold – Es kann durchaus sein, dass Teile bereits verpilzt waren. Man sieht auch in den anderen Bereichen des Bildes, dass keineswegs das ganze Blatt gefärbt ist.
Du fragst nach dem „Objekt ohne Färbung und Fluoreszenz“, könntest du daran erkennen, ob das Objekt verpilzt ist?

Beste Grüße

Michael