Hochbrechendes Einbettmittel im Test

[Rene]

Spraycoating with TiO2? Additional coverslip mounting with canada balsem or whatever should not be the problem for imaging.

Interesting! Looking forward to some superior images from this slide ;-)

Best wishes, René

[olaf.med]

Aber das würde doch rein garnichts bringen. Wichtig ist doch die direkte Immersion der Diatomee etc., und nicht eine evtl.  Beschichtung des Objektträgers oder des Deckglases.

Herzliche Grüße, Olaf

[jochen53]

Hallo Olaf,

ich hab zwar selbst nie mit diesem Titan-Zeug gearbeitet, vielleicht vernetzt es ja transparent.

Jochen

[Soki]

Hallo zusammen,

ich habe mir ehrlich gesagt nie Gedanken darum gemacht, ob die Beschriftung korrekt ist. Ich wusste bis dato lediglich, dass man Quarzkristalle mit Titanium bedampfen kann und die Oberflächliche durch eine chemische Reaktion verändert wird. Diesen farbigen Metallschimmer kann man auf diesem Präparat erkennen.
Ich habe es durch Zufall bei eBay entdeckt und für wenig Geld ersteigert. Die Diatomeen sehen in diesem Medium sehr interessant aus, aber eher wenig detailliert, man kann kaum Strukturen ausmachen.
Bei Interesse kann ich gerne hier oder in einem separaten Thread Bilder im Hellfeld und DIC einstellen.

Grüße,
Simon

[Rene]

Ja bitte, Simon. Wahrscheinlich ist die Metallschicht zu dünn, um genügend Kontrast zu erzeugen.

Hallo Olaf, Ich meinte Beschichtung der Diatomee und dann Einbettung.


Gruesse, René

[Soki]

Hallo Rene',

hier kannst du die Bilder finden: https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=40348.0

Aber wie gesagt: Die Detailarmut ist gut sichtbar, dennoch hübsche Diatomeen.


Ich habe es jetzt endlich auch geschafft, die Poren der Amphipleura pellucida aufzulösen. Ich habe zwei Polfilter vollstaendig gekreuzt und eine Zentralblende verwendet. Der Kondensor mit N.A. 1.4 wurde immergiert, es kam wieder mein Nikon CFN Fluor 100 bei 1.3 NA zum Einsatz. Desweiteren habe ich noch einer schönen Navicula (peregrina?) Pooren entlocken können.

[anne]

Hallo Simon,
gratuliere, Du hast es sogar geschafft ohne die 45°  Orietierung der Diatomee.

lg
anne

[Carlos]

Hallo Simon,
Faszinierende Bilder der A.p. zeigst Du hier. Gratuliere!
Mit Deinen Bildern müsste man der Porenabstand bestimmen können. Leider fehlt aber ein Maßstabbalken.
Kannst Du den noch einfügen oder selbst den Porenabstand bestimmen?
Gruß Carlos

[peter-h]

Hallo zusammen,

für alle, welche Zahlen lieben habe ich noch eine kleine Zusammenstellung. Im Jahr 2007 hatte ich durch einen Zufall Kontakt mit einem Wissenschaftler aus Kalifornien bekommen. Er hatte tolle REM-Aufnahmen bis 100 000x Vergrößerung und hat die Poren vermessen. Also schickte ich auch eine Probe A.pellucida zu ihm mit der Bitte ......
So bekam ich viele recht aufschlußreiche Bilder von ihm. Ich hoffe einen Wissensdurst damit zu stillen.

Nanogrüße
Peter

[anne]

Hallo zusammen,
ich möchte noch zum Eindeckharz mitteilen, dass es mit dem Klebegrund Shellack und Debes getestet wurde.
Weder mit dem Klebegrund Shellack noch mit dem Klebegrund Debes gibt es Probleme (bei richtiger Anwendung vorrasugesetzt), die Mikrofossilien bleiben beim Eindecken an der Stelle, wo sie festgeklebt wurden.
lg
anne

[Herbert Dietrich]

Hallo Anne,

ab wann und wo gibt es das Eindeckmittel zu kaufen, oder habe ich da etwas überlesen?

Herzliche Grüße

Herbert

[anne]

Hallo Herbert und alle weiteren Interessierten,
bitte nimm doch dazu direkt Kontakt mit Hr. Abele auf unter:

mba Abele GmbH
Nägeleshofstr. 80
73434 Aalen

E-Mail: thin-section@t-online.de

Er ist ja auch hier im Forum unter Georg Abele, besser aber man nutzt die von ihm angegebene Kontakadresse.

Ich denke es ist sehr bald erhältlich!
lg
anne

[d65]

Hallo Diatomisten,

ich weiß, ich bin spät dran, aber ich wollte dann doch noch zeigen, was ich mit Annes Präparat, das sie mir freundlicherweise geschickt hat, bisher anfangen konnte. Ästhetisch kommen die Bilder nicht an das ran, was in diesem Thread schon gezeigt wurde, aber da es sich um eine andere Technik handelt als die bisher vorgestellten lohnt es sich vielleicht doch es vorzustellen.

Ich hab das Präparat im Institut unter ein konfokales Laserscanningmikrkoskop (clsm) gelegt und im Reflexionsmodus mit 488 nm aufgenommen. Normalerweise werden Konfokalmikroskope heute für Fluoreszenz eingesetzt, dass es auch anders geht ist vermutlich vielen Nutzern gar nicht bewusst. Bei Konfokalmikroskopie wird eine punktförmige Lichtquelle (fokussierter Laserstrahls) durch das Objektiv im Präparat abgebildet, bzw. das Präparat wird mit diesem verkleinerten Bild der punktförmigen Lichtquelle abgerastert. Wenn es beim Reflexionsmodus durch Brechungsindexunterschiede im Präparat (z.B. Übergang Diatomee zu Einbettungsmedium) zur Reflexion kommt wird das reflektierte Licht vom Objektiv wieder aufgenommen. Beim vorliegenden Fall werden unendlich-Objetive verwendet und im Raum zwischen Objektiv und Tubuslinse befindet sich ein 15/85 Spiegelteiler. Von der Beleuchtung wird dadurch nur 15 % zum Präparat gelenkt, aber 85 % des reflektierten Lichtes können sich weiter zum Detektor ausbreiten.

Hinter der Tubuslinse, in der Zwischenbildebene, befindet sich eine Lochblende (Pinhole). Licht vom Fokuspunkt kommt durch diese Lochblende relativ ungehindert durch. Wir haben aber ja tatsächlich keinen Beleuchtungspunkt, sondern einen Beleuchtungsstrahlkegel. Reflexion gibt es also auch über und unter der Fokusebene. Allerdings wird das Zwischenbild aus anderen Ebenen dann auch vor oder hinter der Lochblende fokussiert, so dass dieses unerwünschte Licht durch die Lochblende weitgehend blockiert wird, da es in dieser Ebene einen Kegel bildet.  Hinter der Lochblende kommt dann noch ein Helligkeitsdetektor, hier ein Photomultiplier-Tube. Das eigentliche Bild wird erst im Computer zusammengesetzt, aus den Helligkeitswerten, die während des Abrasterns des Präparats gemessen werden.

Wozu der ganze Aufwand? Hauptsächlich, weil eben die Signale aus "falschen" Fokusebenen stark unterdrückt werden und sich somit der Kontrast in der Fokusebene stark erhöht. (Siehe auch https://de.wikipedia.org/wiki/Konfokalmikroskop). Es gibt aber auch noch einen netten Nebeneffekt: Die Auflösung eines Mikroskops kann durch die Punktspreizfunktion (engl. point spread function, PSF) beschrieben werden, also wie sich Licht einer punktförmigen Lichtquelle im Bild verteilt. Im konfokalen Mikroskop haben wir nicht nur eine PSF, sondern zwei, nämlich jene, die den Beleuchtungspunkt im Präparat erzeugt und jene, die das Zwischenbild erzeugt. Da beide vom gleichen Objektiv erzeugt werden sind beide identisch. Aber die Gesamt-PSF entspricht dadurch einer quadrierten PSF, was bedeutet, dass die effektive Auflösung besser wird. Und zwar theoretisch bis zum Faktor Wurzel(2) (also 1,44) bei völlig geschlossener Lochblende. (genauere Erklärung bitte beim Physiker des Vertrauens anfordern...) Physik ist insofern lustig, als man auch sinnlose Dinge genau berechnen kann: Wenn die Lochblende völlig geschlossen ist kann man natürlich kein Bild erzeugen weil nichts zum Detektor gelangt. Normalerweise wird daher eine Lochblendengröße eingestellt, die einer "Airy unit" (AU) entspricht (Durchmesser des Beugungsscheibchens bis zum ersten Minimum).  Dann gibt es keine echte Auflösungsverbesserung, aber eben doch deutlich besseren Kontrast.

Lange Rede kurzer Sinn: Wenn man die Lochblende auf kleinere Werte einstellt, zum Beispiel auf 0,25 AU, dann kann man schon eine Auflösungsverbesserung erzielen - wenn man genug Licht aus dem Präparat bekommt. Was bei Reflexion (im Gegensatz zur Fluoreszenz) aber kein Problem darstellt.

Mit Annes Präparat wollte ich einfach mal ausprobieren, wie gut die Muster von Amphipleura pelucida zu erkennen sind. Das Mikroskop hat auch einen motorisierten z-Trieb, mit dem ich einen Bildstapel erzeugt habe. Die Bilder sind in der folgenden Montage untereinander montiert. Aufnahmeparameter: 63x1.4 Öl, Pinhole 0,25 AU, Einzel-Bildgröße 2048x200 Pixel = 105x10,2 µm, Ebenenabstand 0,138 µm. Voxelgröße 51x51x138 nm. Sehr langsame Aufnahme mit nur 10 Zeilen/s um möglichst rauschfrei zu arbeiten. Wellenlänge 488 nm. PMT-Voltage 415V. Aufnahmezeit ca 4,5 min. Die Intensität im Bild wurde linear angehoben, dies und auch die Montage in Fiji. Mehr gleich im nächsten Posting.

[d65]

Das Bild oben ist im Forum verkleinert dargestellt, für die volle Größe bitte drauf klicken und in anderer Software öffnen.

Was man beim obigen Bild sofort sieht ist, dass auch Konfokalmikroskope keine artefaktfreien Bilder erzeugen. Hier besonders auffällig: die Wellenstruktur, die im Hintergrund gut zu sehen ist. Bei Fluoreszenz sieht man das nicht, ich nehme an, dass es eine Interferenzerscheinung des polarisierten Laserstrahls am Deckglas und/oder am Objekt ist.

Außerdem sieht man, dass die Reflexion in den mittleren Ebenen (7+8/15) deutlich stärker ist als am Rand des Bildstapels. Dummerweise sind das nicht unbedingt die interessantesten Ebenen. Im folgenden Bild ist daher die Ebene 2 alleine dargestellt. Da kann man die Einzelpunkte schon erahnen, aber die Interferenzstreifen stören doch ziemlich. Da die Streifen relativ gleichmäßig sind tauchen sie in der Fourier-Transformation im gleichen Bereich auf. Diesen habe ich für das letzte Bild gelöscht, anschließend eine inverse Fourier-Transformation durchgeführt. Auch wenn das Ergebnis noch nicht ideal ist gefällt es mir besser als das Ausgangsbild, da weniger Streifen auf der Schale liegen. Bildverarbeitung wiederum in Fiji.

Auch hier wird es für die Betrachtung der Details womöglich nötig sein, die Bilder herunter zu laden und vergrößert anzuschauen. Die Pixelgröße, die wir hier haben ist mit 51 nm so gewählt, dass sie die mögliche Auflösung darstellen kann. Moderne Monitore haben aber teilweise so kleine Pixel, dass das menschliche Auge den Bildinhalt möglicherweise nicht mehr voll auflösen kann. Dann bietet sich eine Vergrößerung von 200 oder 300 % an. Gleich noch eine Ausschnittsvergrößerung im nächsten Posting.

[d65]

und zum Abschluss hier noch eine Ausschnittsvergrößerung aus dem vorherigen Bild, nahe des linken Randes. Hier wurde schlicht in IrfanView die Bildgröße vervierfacht. Natürlich wird die Auflösung dadurch nicht tatsächlich besser, je nach Hardware wirkt es aber für das menschliche Auge informationsreicher, da die Einzelheiten jetzt größer sind.

Liebe Grüße
Steffen