Präparation biologischer Proben für REM-Aufnahmen - was ist Euer Protokoll?

[Bayer]

Liebe REM'ler,

ich würde mal gerne interessante biologische Präparate unters REM legen.

Da gibt es ja sehr schöne Aufnahmen von Ameisen, Moskitos, Bienen, Fliegen, Läusen, Spinnen, Milben, Bärtierchen, Federn, Schmetterlingsschuppen, Hautoberflächen, ... (z.B. hier im Forum oder im Buch Microcosmos von Brandon Broll).

Jetzt müssen diese Proben ja vakuumresistent sein / gemacht werden und die Oberflächen sollten sich nicht aufladen.

Das war bisher mit speziellen Präparaten wie z.B. Diatomeen kein Problem.

Oder bei Steinen:

https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=31793.0
(hier beschreibt Wilfried auch eine Probenpräparation fürs TEM - Probendicke <100nm)

Sobald organische Stoffe dabei sind, wird meines Wissens folgendes Protokoll empfohlen:

1) Trocknung über eine Alkoholreihe
2) kritische Punkt Trocknung
3) Sputtern

Bzw. Punkt 3 wird eigentlich sehr häufig empfohlen - habe das bisher aber noch nich anwenden müssen.

Welche biologischen Präparate habt Ihr Euch denn schon unterm REM angeschaut?

Wie war dabei der Probenzustand und Euer Protokoll der Probenvorbereitung fürs REM?

Ihr könnt auch gerne Eure Aufnahmen hier verlinken mit dem Präparations- / Aufnahmeprotokoll, wenn Ihr wollt.

Was auch interessant wäre: Eure Nachbearbeitung der Aufnahmen, wie z.B. Kolorierung.

Bin mal gespannt auf Eure Antworten.

Beste Grüße
Christian

[wilfried48]

Lieber Christian,

das ist ein weites Feld und je nach Empfindlichkeit der Proben kann man das mehr oder weniger aufwändig betreiben.

Auf jeden Fall sollte bei empfindlichen Proben noch ein Fixierungsschritt (Formalin, Glutaraldehyd) vorgeschaltet werden.

Du solltest vor dem Fragen vielleicht auch mal die Suchfunktion des forums bemühen.

Unter dem Suchbegriff REM findet man z.B. folgendes:
https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?action=search2;params=eJwtzjEOwjAMBdC7sLD8IbaTtD0AIwsXqNrEUkGFoLSAkHJ4UtTF-v8t30N8D4-gsRyLKYcy5i0RGGQgaEGCDkQghliwAXWwBtyCLYQg1QXM4Hod2IMbcAdxEI8G5EAe1MDDwtWFZUqfPqT7c9ZV69ZGr_GmYe3TY_7ukvJaU9ZZ_-_t1Mdrrhx1CZvokMNU--V0_gEPHzxp;start=0

Das ist mal für ein paar Tage Lesestoff und dann kann man immer noch gezielter fragen.

viele Grüsse
Wilfried

[Bayer]

Sind ja nur 60 Einträge, dass kann ich mal zusammenfassen.

[wilfried48]

falls du besonders fleissig sein willst, kannst du auch noch das Suchwort Elektronenmikroskop durchschauen,
da gibt es sicher auch noch ein paar Antworten auf deine Fragen:

https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?action=search2;params=eJwtzksOgzAMBNC7dNPNLGLnA5wGQWIJCiRVoK0q5fANFRtr_GRpPIT3EL2Eci-q3MqYz0RgkIJGC9LoQARiaANWoA5GgVuwgSbo6hrM4Dot2IEbcAdtoR0akAU5UAMHA1sb9il9ep-25yqH1K6TXuND_NGnuH4vSfmoKcsq__cu6sOcKwfZ_SkyZD_VvV4tR05R4jYvOe1Lev4AFgxDmw..;start=0

viele Grüsse
Wilfried

[Bayer]

So, das ist jetzt eine sehr kurze Zusammenfassung bzgl. der Informationen zu Präparationstechniken von Proben für REM-Aufnahmen aus Wilfried's link "auf die Schnelle":

Es scheint, ganz grob, folgende zwei Ansätze, abhängig vom Präparat, zu geben:

Zu über 90% wird im Mikroforum das CPD (critical-point-drying) nicht angewendet und dafür Präparate gewählt, die auch ohne CPD sehr gute Bilder unterm Elektronenmikroskop liefern.

Weniger als 10% (überwiegend Eckhard und Christian3000) scheinen über die technischen Möglichkeiten für CPD zu verfügen und den damit verbundenen Aufwand nicht zu scheuen. Das CPD erschliesst dann ganz neue Dimensionen und eine Vielzahl weiterer biologischer Präparate für die elektronenmikroskopische Untersuchung.

(1) Mit CPD: Biologische Präparate wie Amöben, Sonnentiere, Pflanzenblätter, Pilze, Algen, Protoblasten, ...
- Entwässern, CPD, Sputtern (da kommt man nicht drum herum, aber die Aufnahmen sind wirklich extrem gut)

(2) Ohne CPD: Mineralien, Schmetterlinge, Diatomeen, Radiolarien, Kieselalgen, Foraminiferen, Pollen, Insekten, Halbleiter, Tümpel, ...
- Lufttrocknen, Sputtern (CPD wird ausgelassen oder manchmal sogar auch das sputtern, "schwaches" Vakuum in der Kammer einstellen) - (und die Aufnahmen sind auch schon überwältigend)

Über jede Ergänzung und Tipps und Tricks bin ich dankbar!

Mineralien
- https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=29025.msg216388#msg216388 (wilfried48)

+ " ... der beste, schnellste und sauberste Weg  einer temporären Abdeckung ist die klassische Verwendung von Kanadabalsam - nein, nicht die Xylol-Pampe der Biologen, sondern als naturbelassenenen Thermoplast. Dieser schmilzt, je nach Zusammensetzung, bei ca. 80-120°C, was dem  Epoxydharz Araldit überhaupt nicht schadet. Reste sind schnell mit Aceton o.Ä. zu entfernen. Als Kittofen kann man einfach ein umgedrehtes Bügeleisen verwenden (nicht von der Gattin erwischen lassen!!!!). Ähnliche Thermoplaste kann man unter verschiedenen Namen beziehen, z.B. unter "Crystalbond" (ole.med)
+ "Wenn Du einen nicht abgedeckten Dünnschliff hast, solltest Du ihn mit einem Standard-Immersionsöl mit dem Brechungsindex n=1,51 und einem Deckglas abdecken. Nur so bekommst Du definierte Verhältnisse und kannst das Relief vernünftig abschätzen" (olaf.med)

Amöben / Sonnentierchen - SUPER!!!
- https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=19274.0 (Eckhard)
- https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=25715.msg192889#msg192889 (Eckhard)
- https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=28902.msg215516#msg215516 (Eckhard)
- https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=23650.msg175742#msg175742 (Eckhard)
- https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=18376.0 (Eckhard)

+ "Als Sputter Material benutzen wir Platin, die Aufnahmen wurden mit 3.5 mm Arbeitsabstand, 1 kV Beschleunigungsspannung und dem In-Lens Detektor gemacht. Zur Präparation werden die Amöben fixiert, dann über die aufsteigende Alkoholreihe entwässert und mit einem Kritischen Punkt Trockner getrocknet" (Eckhard)
+ "Präparation ist standard - Fixierung, Entwässerung durch die Alkoholreihe und Trocknung mit kritischem Punkt Trockner. Die Schuppen sind anorganisch und recht stabil. Wir kultivieren Proben in Petrischalen mit Deckgläschen. Die Deckgläschen werden herausgenommen und präpariert. In der Regel haften die Tierchen da drauf. Manchmal muss man eben mit Poly-L-Lysine etwas nachhelfen" (Eckhard)
+ "Gold ist grober und kann nicht sinnvoll bei sehr hohen Vergrößerungen benutzt werden. Chrom ist wohl am besten, oxidiert aber sofort. Platin geht bis 300.000x recht gut" (Eckhard)
+ "Ich plane von "Mikrotierchen" Aufnahmesequenzen anzufertigen, daraus 3D Daten zu generieren und davon Hologramme anzufertigen sowie - falls ich eine geeignette Software finde - 3D Objekte zum Anfassen auszudrucken. Dazu müssen die Tierchen entsprechend präpariert werden damit diese lange und sehr stabil und ohne Aufladungen "still halten". Hast Du mit HDMS zum Entwässern und OsO4 (+ evtl. Au/Pd oder Pt) zum Fixieren Erfahrungen?"  (bernd522)

http://protistology.ifmo.ru/num11_4/udalov_protistology_11-4.pdf

Pflanzenblätter - SUPER!!!
- https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=26022.msg195468#msg195468 (Christian3000)
- https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=27394.msg205563#msg205563 (Christian3000)
- https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=25922.msg194596#msg194596 (Christian3000)

+ Lufttrocknung & Besputtern - will CPD ausprobieren - sehr schöne Diskussion, z.B. Problematik der Restfeuchte, strukturerhaltende Trocknung, schonende chemische Verfahren (und endlich weiss ich, wer Christian3000 ist ;-)
+ "... in Kakodylatpuffer/Glutardialdehyd fixiert, in aufsteigender Alkoholreihe entwässert, in Aceton überführt und kritisch Punkt getrocknet. Gesputtert wurde mit Platin. Das Präparat habe ich allerdings nicht selbst hergestellt, sondern von Stefan bekommen, vielen Dank an dieser Stelle!" (Christian3000)
+ "Zu den Präparaten: ... habe ich nicht selbst präpariert sondern fertig bekommen. Die Präparation nach dem Universalprotokoll erfordert bedenkliche Chemikalien, mit denen man in einem Labor problemlos umgehen kann (Abzug, geeignete Entsorgungswege), zu Hause möchte man dies wohl nicht tun, hier nochmal die Schritte: (1) Fixierung in einem Puffer aus Kakodylat (Salz der Dimethylarsensäure) mit Glutardialdehyd (muss man im Kühlschrank aufbewahren). U.U. noch Behandlung mit Osmiumtetroxidlösung; sehr giftige Schwermetallverbindung. Fixiertes Gewebe wird tiefschwarz durch reduziertes Osmium. OsO4 hat einen hohen Dampfdruck, wenn diese Dämpfe die Hornhaut treffen, wird auch sie tiefschwarz, was für den Mikroskopiker nachteilig ist (sorry für den geschmacksarmen Scherz, aber es stimmt wohl). (2) Die nun folgende aufsteigende Alkoholreihen und die Überführung in Aceton sind eher problemlos. (3) Trocknung: Ein üblicher Weg ist die Kritisch-Punkt-Trocknung (CO2 bei 80 bar)" (Christian3000)
- "Für die höher vergrößerten Aufnahmen würde ich näher rangehen. 33 mm Arbeitsabstand sind bei der Vergrößerung schon heftig, ich arbeite i.d.R. mit einem Zehntel" (Eckhard)

Pilze
- https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=22856.msg170225#msg170225 (karinaeva)

+ "Das Sputtern geschieht im Vakuum und dabei gast ein nicht fixiertes, nicht getrocknetes Präparat aus. Bei empfindlichen Strukturen gibt das Artefakte" (Eckhard)
+ "aus meiner längstverschütteten Vergangenheit als Pilzforscher kann ich mich auch noch erinnern, dass die critical point Trocknung miserable Ergebnisse zeitigte im Vergleich zur Schockfrostung (Stickstoff mit Isopropanolschlicker als Kälteleiter) - auch da spielte anscheinend ein ordentlicher Chitingehalt der Zellwände eine Rolle" (reblaus)

Schmetterlinge
- https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=25707.msg192802#msg192802 (Christian3000)
- https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=25597.msg191918#msg191918 (the_playstation)
- https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=25709.msg192828#msg192828 (anne & wilfried48)
- https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=25699.msg192754#msg192754 (the_playstation)
- https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=25798.0 (anne & wilfried48)
- https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=25740.msg193104#msg193104 (anne & wilfried48)
- https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=26416.msg198320#msg198320 (anne & wilfried48)
- https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=20226.msg151892#msg151892 (Eckhard)

+ Beim Besputtern gehe ich z.Zt. so vor, dass ich lieber etwas zu wenig aufsputtere und schaue ob sich noch was auflädt bzw. bewegt und dann gegebenenfalls noch etwas nachsputtere. Ausserdem benutze ich zur zeit noch Au/Pd , was die erzielbare maximale sinnvolle Vergrösserung auf ca. 50 000 - fach einschränkt und bis dahin stehen die Schuppen gut genug stabil. Für die Schmetterlingsschuppen und die Diatomeen scheints es auf jeden Fall zu reichen ... (wilfried48)
+ "Gesputtert haben Wir recht dick mit Gold" (the_playstation)
+ "Flügel mit Pinsel betupfen, um die Schuppen auf den Pinsel zu übertragen, Objektträger anhauchen (wichtig) und die Schuppen auf den Objektträger tupfen. Danach trocken abdecken" (the_playstation)

Tümpelprobe
- https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=5279.msg35844#msg35844 (bewie)
- https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=29535.msg219880#msg219880 (bernd522)

"Fixiert wird mit Mitteln, die die Oberfläche stabilisieren und härten. Bei normalen histologischen Proben soll die Oberfläche ja nicht so schnell härten, damit das Fixiermittel möglichst flott in die Tiefe eindringen kann und auch insgesamt soll das Gewebe nicht so hart werden, damit es schneidbar bleibt. Mir geht es vor allem darum, die Oberfläche möglichst ohne Verformung zu stabilisieren; wie die Probe innen aussieht, ist nicht so wichtig. Allerdings muss auch innen noch genügend Stabilität herrschen, sonst verformt sich die Probe in den späteren Präparationsschritten. Die Probe hier wurde mit dreiprozentigem Glutardialdehyd (in Leitungswasser) fixiert, dann über mehrere Stufen in 100prozentiges Isopropanol überführt und darin gelagert. Auch hier wieder ein Unterschied zur normalen Histologie: Dort würde man man in 70prozentigem Isopropanol lagern, weil damit der beste Kompromiss zwischen Konservierung und Härtung erzielt wird. Getrocknet habe ich diese Probe mit HMDS (Hexamethyldisilazan). Zu diesem Zweck wird die Probe über mehrere Mischstufen in 100prozentiges HMDS überführt, das ich anschließend verdunsten lassen. HMDS hat eine extrem niedrige Oberflächenspannung und lässt daher beim Trocknen die Oberfläche intakt - es gibt einiges an Literatur zu dieser Methode. Es muss aber wirklich 100prozentig sein, sonst gibt es Probleme. Auch ist HMDS längst nicht für jedes Material geeignet. Anschließend wird die Probe mit einem leitfähigen Kleber auf das Probentischchen geklebt und mit Gold besputtert - danach kann sie in die REM-Kammer" (bewie)

3D-Aufnahmen mit dem REM
- https://www.biospektrum.de/blatt/d_bs_pdf&_id=1404574 (Cypionka)
- https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=31683.0 (Stuessi)
- http://www.picolay.icbm.de/SEM3D-tutorial.pdf (Cypionka, Völcker, Rhode)

Diatomeen / Radioloarien / Kieselalgen / Foraminiferen
- https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=29091.msg216877#msg216877 (bernd552)
- https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=25791.0 (wilfried48)
- https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=28930.msg215781#msg215781 (sushidelic)
- https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=31598.msg234230#msg234230 (bernd522)
- https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=30189.msg224416#msg224416 (bernd522)
- https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=28941.msg215848#msg215848 (bernd522)
- https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=28941.0 (bernd522)
- https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=30449.msg225958#msg225958 (bernd522)
- https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=26542.msg199241#msg199241 (anne & wilfried48)
- https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=30515.msg226553#msg226553 (bernd522)
- https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=29608.msg220524#msg220524 (bernd522)
- https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=28057.msg210209#msg210209 (anne & wilfried48)
- https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=30045.msg223460#msg223460 (bernd522)
- https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=29022.msg216371#msg216371 (wilfried48)
- https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=22439.msg167091#msg167091 (anne)
- https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=28656.msg213903#msg213903 (wilfried48)
- https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=29053.msg216594#msg216594 (bernd522)
- https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=26209.0 (anne & wilfried48)
- https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=24861.msg185590#msg185590 (peter-h)
- https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=30578.msg226899#msg226899 (bernd522)
- https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=25510.msg191170#msg191170 (anne & wilfried48)
- https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=29028.msg216410#msg216410 (bernd552)
- https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=27430.msg205828#msg205828 (anne & wilfried48)

+ Bedampfung mit Gold/Palladium, Plasma zur schonenden Reinigung von organischen Substanzen (macht wilfried48)
+ Präparate in destillierten Wasser / Lösungsmittel. Manipulation mit einer zum Y gespaltenen, eigenen Wimper und einem geätzten Wolframdraht (Spitze ca. 10 nm dünn). Kleber ist ein Eigengebräu eines UV härtbaren Acrylat-Klebers (macht bernd522)
+ ,,fraktionierenden (pulsierenden) Gegenstrom-Sedimentation" (bernd522)
+ "native Diatomeen, die noch keinen mechanischen Streß durch Zentrifugation, Kochen, Säurebäder mit Gasbildung in den Filigranstrukturen usw. ausgesetzt waren. Außerdem arbeite ich sehr verdünnt in Gegenwart von Netzmitteln, so dass Kollisionen / Konglumerate mit Schmutz etc. minimiert sind" (bernd522)
+ "es wurde mit Gold gesputtert. Wie üblich Argongas bei 20mA und etwas mehr als 6 Min. Über die resultierende Schichtstärke kann ich jetzt nichts sagen. Ich habe mich auch nicht um den Sputter gekümmert. Die Bilder sind bei 10kV und teilweise 20kV gemacht" (peter-h)
+ Reinigung nach Göke http://www.mikrohamburg.de
+ "Ich habe in eine Petrieschale mit Durchmesser 55 mm und Höhe 10 mm, die ich normalerweise zur Beobachtung auf dem Umkehrmikroskop verwende auf den Boden 5 Deckgläschen mit 10 mm Durchmesser gelegt. Die Deckgläschen waren ohne jede Vorbehandlung. Darüber wird die Petrischale mit dem Konzentrat aus dem Planktonnetz gefüllt. Die Einwirkungszeit betrug solange wie ich die Probe sowieso auf dem Umkehrmikroskop hatte, ca. 1 Tag. Dann wurde in Glutaraldehyd fixiert mit H2O gewaschen mit Isopropanolreihe in 100% Isopropanol überführt und eintrocknen lassen.
Anschliessend wurde mit AuPd besputtert. Da ich ja nur nach den Kieselalgen geschaut habe war mir die kritische Punkttrocknung zu aufwändig und HMDS hätte die Kieselalgen sicher auch nicht aretefaktfreier getrocknet. Dickere Fadenalgen sahen aber durch die unorthodoxe Trocknung schon arg vermatscht aus. Ich habe aber noch unbesputterte Proben, da werde ich den Plasmaverascher mal ausprobieren. Es könnte aber auch sein, dass dann die Kieselalgen sich aufladen und vom Substrat springen, zumal ja auch ihre organischen Anker zum Substrat verascht werden. Und ob sie danach besser aussehen ist auch noch die Frage. Ich finde die natürliche Patina auf den Kieselalgen im REM  eigentlich nicht störend und die innere Füllung stört, im Gegensatz zum Durchlichtmikroskop, im REM ja auch nicht" (wilfried48)
+ "Was ich aus den Vergleichen lerne ist, dass mir ein 100er Objektiv unerwartet viel von dem zeigt, was im REM Bild zu sehen ist" (anne)
+ Diatomeen legen: http://www.mikrohamburg.de/Programm/Protokoll_20170218.pdf
+ "Vorbereitung der Kieselalgen für bessere REM-Aufnahmen: ... z.B. Gelatine als Kleber - wie bei den aktuellen Proben - würde ich lieber vermeiden und dafür meine eigens dafür optimierten UV-Kleber nehmen, das würde aber heißen, dass ich diese erstmal selber legen müßte ... Kurzum, wenn ich entsprechendes Material z.B. als Aufschlämmung zur Verfügung hätte, dann könnte ich dieses so positionieren, wie ich es optimal brauche und könnte dann (das ist mein Ziel) u.a. 180° Rundumfahrten mit Zooms ect. als Video machen, da wären alle Ansichten der Schönlinge vorhanden (bernd522)

Insekten / Milben
- https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=17059.msg130598#msg130598
- https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=25747.msg193141#msg193141 (the_playstation)

Differentielles Vakuum einstellen, Bedampfung nicht notwendig (Detlev Kramer)

Algen
- https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=19333.msg147387#msg147387 (Eckhard)

Keine Beschreibung der Präparation

Protoplasten
- https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=25758.msg193194#msg193194 (Christian3000)

Nur TEM Protokoll

Pollen
- https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=26222.msg197239#msg197239 (wilfried48)
- https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=26173.msg196781#msg196781 (wilfried48)
- https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=26178.msg196815#msg196815 (wilfried48)
- https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=26189.msg196925#msg196925 (anne & wilfried48)

Lufttrocknung, Evakuierung, Sputtern

Kolorierung
- https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=22856.msg170225#msg170225 (karinaeva)
- https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=29696.msg221128#msg221128 (bernd522)
- https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=29827.msg221922#msg221922 (bernd552)

... nachdem ich herausgefunden habe, wie man bei Photoshop (PS) von Grauwerten auf RGB umschaltet, recht schnell gegangen ...

Halbleiter
- https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=20082.msg150840#msg150840 (Markus1201)

Schöne technische Diskussion der REM-Bedienung, keine Präparation

Gefriertrocknung
- https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=28819.0 (motte)

Interessante Download-links (allgemein)
https://www.mikroskopie-forum.de/index.php?topic=16694.msg129007#msg129007

[Bayer]

Kontrastentstehung im Rückstreuelektronenkontrast (BSE):

Detektion von zurückgestreuten Elektronen (engl. backscattered electrons, BSE). Diese vom Objekt zurückgestreuten Primärelektronen haben eine typische Energie von einigen keV. Die BSE- Ausbeute ist abhängig von der mittleren Kernladungszahl Z der Probe. Bereiche mit einer höheren mittleren Kernladungszahl erhöhen die Wahrscheinlichkeit einer Rückstreuung. Solche Bereiche erscheinen daher in einem BSE- Bild heller, man spricht vom Materialkontrast. Der Materialkontrast ist für kleinere Z größer als für große Z. Schwere Elemente sorgen für eine starke Rückstreuung, so dass entsprechende Bereiche hell erscheinen. Bereiche mit leichteren Elementen erscheinen hingegen dunkler.

[Bayer]

Das "Critical-Point-Drying"-Verfahren (CPD) hat Eckhard übrigens hier sehr gut beschrieben:

http://protistology.ifmo.ru/num11_4/udalov_protistology_11-4.pdf

[JMB]

Hallo Christian,

vor Jahren habe ich mal Seegurken-Spermien nach der AXA-Methode getrocknet, um sie dann im REM untersuchen zu können. Dies Methode wurde von Kees van Achterberg (Naturalis, Leiden, Niederlande) als eine Abwandlung der Alkohl-Ethylacetat Trocknung nach (Vockeroth, 1966) entwickelt. Hierbei wird das Ethylacetat durch Amylacetat ersetzt. Die Prozedur selbst war sehr einfach und zumindest für mein Vorhaben auch brauchbar.
Proben wurden von 70 % Ethanol (Museumsmaterial, leider selten gut fixiert) für 24 h in Mischung aus 40 % Xylol und 60 % Ethanol (96 %) überführt, anschließend in Amylacetat überführt und für 24 h getrocknet. Die so getrockneten Proben konnten dann ohne weitere Schritte auf die Probenteller aufgebracht und besputtert werden.
Auf dem Bild sieht man dann das Ergebnis.

mit freundlichen Grüßen,

Jens

Vockeroth, J.R. (1966) A method of mounting insects from alcohol. Canadian Entomologist, 98, 69–70.
(Bild aus Bohn & Heß 2014: Fig 2f, g http://dx.doi.org/10.11646/zootaxa.3841.4.7, CC BY 3.0 http://creativecommons.org/licenses/by/3.0)

[Eckhard]

Hallo,

Über dieses Thema sind schon ein paar Dutzend Bücher geschrieben worden. Auch wenn es ein paar dokumentierte Standards gibt, richtig gute Aufnahmen bekommt man nur, wenn das Protokoll der Probe angepasst wird, besonders bei Protisten. Es ist recht einfach, Paramecium bursaria zu präparieren, wesentlich schwerer bei P. caudatum. Ein Stentor ist die Hölle und meines Wissens noch niemandem gelungen.

Man muss zwischen Zelltot und Stabilisieren unterscheiden, d.h. den Prozess der Fixierung aufteilen. Zum Töten der Protisten wird meistens Glutaraldehyd genommen, bei Ciliaten auch Quecksilber(II)-chlorid. Zum Stabilisieren kommt i.d.R. Osmiumtetroxid zum Einsatz.

Man kann beides mischen und in einem Schritt machen oder hintereinander. Bei Raumtemperatur oder auf Eis. Man puffert den pH Wert und muss die Konzentration des Puffers anpassen, sonst hat man eingefallene oder aufgeblähte Präparate. Manchmal müssen die Protisten an Kulturmedien gewöhnt werden, in denen eine bestimme chemische Verbindung oder ein Element vollkommen fehlt. Besonders schwierig ist die Fehlersuche. Mit der Zeit entsteht die Erfahrung und ein Gefühl, wie es für ein neues Präparat gehen könnte.

Wer sich das erarbeiten will, muss mit einer langen Lehrzeit (>12Monate) rechnen und viel Frust und Misserfolge ertragen. Wenn man nach 10 Stunden Arbeit ein leeres Deckglas im REM betrachtet, ist das recht frustrierend. Es hat bei uns fast zwei Jahre gedauert, bis wir das wirklich in Griff hatten. Die Schwierigkeit ist, dass eine gute Aufnahme mit einer guten und sauberen Kultur beginnt, danach Fixierung, Entwässerung, Trocknung und Besputtern richtig gut gelingen müssen und dann muss auch am REM noch alles stimmen. Die einzelnen Prozessschritte haben nur eine geringe Fehlertoleranz, i.d. R. führt jeder kleine Fehler zum Misserfolg.

Ich bin immer etwas zurückhaltend bei diesem Thema, denn es ist wirklich sehr aufwendig und führt i.d.R. nicht zu dem erwarteten Ergebnis, wenn man nicht sehr viel Zeit und Aufwand investiert.

Herzliche Grüße,
Eckhard

[Bayer]

Hallo Jens,
hallo Eckhard,

vielen Dank für Eure Antworten.
Wenn ich CPD angehe, dann würde ich das nicht alleine machen, sondern mir Unterstützung suchen.
Schön zu wissen, das es hier im Forum auch dafür Experten gibt.

Beste Grüße
Christian